甲状腺癌的诊断与治疗正经历深刻变革，液体活检作为一种非侵入性方法，通过分析血液等体液中的肿瘤相关标志物，为实时监测疾病提供了有效工具。本综述聚焦于循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和外泌体这三大核心液体活检标志物的技术进展与临床转化。
循环肿瘤细胞
CTC是指从原发或转移灶脱落并进入外周循环系统的癌细胞。它们在血液中含量极低，但可动态监测，为评估手术疗效、预测复发风险提供了直接依据。CTC的分离策略主要分为基于物理特性（如大小、可变形性）和基于生物亲和性（如表面标志物）两类，微流控技术常作为集成这些策略的平台。
基于物理特性的分离技术利用CTC与白细胞在直径上的差异进行分选，但可能因细胞尺寸相近而漏掉近一半的CTC。声学放大分选技术则通过将CTC与抗EpCAM/明胶包被的微球特异性结合，显著增强了其声辐射力，实现了高回收率、高纯度和高细胞活性的分离。Celsee系统利用细胞尺寸和可变形性差异，在微流控芯片的捕获腔室中捕获CTC，而允许白细胞通过，从而获得高纯度CTC。
基于生物亲和性的分离技术依赖于抗体、适配体等配体与CTC表面特异性抗原的结合。CellSearch是目前唯一获得FDA批准的CTC富集平台，但因其基于EpCAM的捕获方法，难以全面捕获具有不同表型的细胞。有研究使用基于生物素-链霉亲和素系统的“分子触手”芯片，将EpCAM抗体偶联到柔性DNA链上，显著提高了EpCAM阳性CTC的捕获效率。Song等人开发了一种基于适配体识别CTC表面标志物并触发杂交链式反应的新策略，形成的DNA水凝胶涂层实现了CTC的可控掩蔽和无损释放。主流的CTC分离技术仍依赖于表面特异性抗原与配体的结合，研究表明大多数CTC表面表达EpCAM。通过在微流控分离芯片表面修饰EpCAM抗体，可以特异性捕获CTC。此外，click-handle-loaded M13 phage-based surface平台利用甲状腺癌中循环肿瘤干细胞低增殖活性的特点实现代谢靶向，其多价纳米纤维增强了捕获能力，分离效率超过80%，为无创监测放射性碘耐受、靶向治疗耐药和去分化转化过程提供了关键细胞靶标。
微流控芯片因其简单、微型化、高通量等优势备受青睐。例如，单细胞免疫印迹微流控芯片集成了无标记惯性分选与膜富集技术，实现了单细胞水平CTC的高效捕获及其上皮-间质转化表型变化的动态分析。光流式细胞仪集成了多级微流控技术与四色荧光检测，促进了CTC的全自动、高通量捕获，回收率>95%，同时促进单细胞三维聚焦和EMT表型分析。表面增强拉曼光谱集成芯片不仅可通过尺寸筛选捕获CTC，还能使用光谱学、正交适配体纳米探针检测多种单细胞膜蛋白。一种新型微流控平台结合了基于尺寸的分选与双靶向磁珠，将异质性CTC的捕获效率提高了20%，并能通过MMP-9水解释放高活力的细胞。此外，Ion Torrent PGMTM系统与Ion AmpliSeqTMCancer Hotspot Panel结合，已直接用于检测甲状腺癌CTC的基因突变，有效消除了存在系统偏倚的全基因组扩增步骤，显著提高了突变检测的准确性。
在临床意义上，CTC计数及动态变化可作为直接生物标志物，有助于评估手术疗效和预测复发风险。在甲状腺癌中，CTC的核心价值目前更多地体现在术后疗效动态监测和预后评估。对甲状腺乳头状癌患者术前术后外周血CTC的分析显示，术后CTC计数显著下降，这在有淋巴血管侵犯、淋巴结转移或BRAFV600E突变的患者中尤为明显。这表明CTC水平降低可作为手术成功的生物标志物，持续降低提示复发风险较低，而持续高水平则与侵袭性肿瘤特征相关。
异质性CTC亚群的分布为分析肿瘤转移潜能提供了更全面的视角。CTC包括上皮CTC、间质CTC和上皮-间质CTC三种亚型。这些亚群的分布模式与肿瘤侵袭性和转移潜能相关。例如，间质CTC或上皮-间质CTC比例升高表明肿瘤生物学行为更具侵袭性。此外，血液中异质性肿瘤细胞簇的存在是转移性甲状腺癌的早期预警和不良预后指标。靶向驱动簇形成和转移的关键分子具有治疗潜力，其表达水平也可作为预测患者生存的液体活检生物标志物。
目前，CTC研究领域正经历从简单计数和表型鉴定向功能分析和机制探索的根本性转变。NanoVelcro芯片技术能够同时无损捕获CTC簇和单个CTC。晚期神经内分泌肿瘤中CTC簇外观的变化与肽受体放射性核素治疗的反应和预后显著相关。单细胞多组学技术实现了对CTC的深入分子分析，这为研究甲状腺癌转移机制提供了新方法。CTC的集成多维分子特征也将构成有价值的液体活检生物标志物系统的基础。
总之，功能CTC分析中最有前景的预后生物标志物集中在两方面。首先，间质CTC/上皮-间质CTC比值反映了EMT状态，直接评估了肿瘤侵袭性。其次，CTC簇的检测展示了肿瘤的成簇播散能力。从技术转化角度看，CTC分型技术已相对成熟，但在临床结果解读和标准化方面仍需广泛共识。对于具有生物学意义的CTC簇，其高效捕获技术、形成机制和精准临床预后价值的研究仍处于起步阶段。
CTC检测面临多重挑战，其中最显著的是捕获和识别低丰度样本的困难。目前的技术限制也使CTC检测不足以识别存在微转移或早期癌症的患者。虽然CTC可作为甲状腺乳头状癌术后疗效动态监测的非侵入性生物标志物，但其术前诊断价值有限，无法替代超声引导下细针穿刺活检作为组织病理学诊断的金标准。目前，全球范围内缺乏统一的CTC检测平台、标准化操作程序和结果解读系统，使得不同研究间的数据难以比较和整合。同时，CTC检测过程复杂，依赖专业设备和高技能操作人员，导致成本高昂，这极大地限制了其在常规临床实践中的应用。
CTC在甲状腺癌中最有前景的应用包括手术疗效的实时监测和复发的早期风险分层。前瞻性研究表明，CTC计数有可能评估甲状腺切除术后的治疗反应，从而动态反映肿瘤负荷。此外，CTC有可能支持个性化治疗策略，包括识别耐药机制和评估转移潜力，从而为临床决策提供非侵入性基础。
CTC的存在在乳腺癌和前列腺癌等实体瘤中具有明确的临床相关性。然而，在当前甲状腺癌的液体活检研究中，CTC作为一种关键生物标志物仍处于临床转化的早期阶段。这些生物标志物在甲状腺癌中的临床验证不足，大部分证据来自有限的前瞻性研究。例如，在甲状腺乳头状癌患者中，CTC计数作为评估手术疗效的非侵入性标志物，但尚未获得广泛的监管批准或实现临床标准化。支持CTC验证的研究很少，且大多规模小，未在多中心进行。
CTC检测存在诸多挑战，包括细胞分离效率低、操作程序复杂、成本相对较高，尤其是在区分循环癌症干细胞亚群方面存在重大技术困难。同时，ctDNA等替代生物标志物更易于实施，因为它们不需要专门的细胞分离方法，这凸显了CTC在成本效益方面的相对劣势。此外，临床应用中缺乏统一的技术标准和共识，进一步限制了其可扩展性和经济可行性。
循环肿瘤DNA
ctDNA来源于肿瘤细胞凋亡、坏死或主动释放，大小在50-250 bp之间。其释放水平受肿瘤增殖活性、体积和分级影响，并能同时反映原发灶和转移灶的分子特征。ctDNA可作为特征性肿瘤标志物，全面呈现肿瘤细胞群的遗传变异信息。ctDNA的变化可用于预测免疫治疗的应答。研究表明，免疫治疗前后ctDNA水平的变化与患者对治疗的反应显著相关，且这些变化早于常规临床影像学评估结果。血浆ctDNA浓度的变化与肿瘤负荷、肿瘤分期和治疗反应显著相关。目前的ctDNA检测方法已扩展到各种体液。ctDNA检测主要关注碱基替换、插入和缺失。需注意的是，ctDNA半衰期短，为16-150分钟，且高度碎片化。因此，样本必须快速处理以防降解。
在早期甲状腺乳头状癌中，ctDNA的诊断效能仍存在相互矛盾的结果。研究表明，基于特定基因甲基化的血浆ctDNA生物标志物可以有效区分甲状腺乳头状癌与良性甲状腺结节，提示其诊断潜力。然而，其他研究未能最终确定ctDNA检测与原发性甲状腺乳头状癌患者预后之间的关联。这些矛盾的结果可能源于多种因素。一方面，早期甲状腺乳头状癌通常肿瘤负荷低，可能导致ctDNA释放减少和检测困难。另一方面，甲状腺乳头状癌具有分子异质性和侵袭性差异，这进一步影响ctDNA释放水平和检测一致性。此外，研究间在样本类型、预处理方法和检测灵敏度方面的差异可能导致结果不一致。
目前，基于不同原理的ctDNA分离检测技术主要可分为四大类：数字PCR、靶向NGS、甲基化分析以及微流控和新型传感技术。
基于PCR的检测方法，包括液滴数字PCR、定量PCR和BEAMing技术，可检测突变等位基因频率低至0.01%的低频突变。在液滴数字PCR中，通过将样本DNA分割成微滴，并通过荧光信号确定的阳性和阴性微滴比率进行统计分析，从而对目标序列进行绝对定量。液滴数字PCR具有操作简单、建库快、样本要求低、灵敏度超高等优点，在检测甲状腺未分化癌的游离DNA方面表现出高灵敏度和特异性，能准确反映其肿瘤突变状态。然而，其靶向检测的特性限制了其并行分析多个基因的能力。BEAMing技术是乳液PCR的增强形式，它允许在单管反应中同时扩增多个模板，并能通过结合引物的磁珠有效回收目标产物。例如，BEAMing技术可用于甲状腺未分化癌的微小残留病检测。为了克服传统液滴数字PCR通量的限制，已开发了多项技术创新。Nie等人使用分步乳化技术在玻璃芯片上创建纳米液滴阵列，开发了一个多重数字PCR平台，可同时检测八个样本，检测限为10拷贝/微升，动态范围跨越四个数量级。
基于靶向富集的技术，在高通量平台上实现超灵敏靶向检测。基于血浆的综合NGS是甲状腺癌一种有前景的NGS方法。例如，使用Guardant360®平台进行的大规模血浆ctDNA测序表明，该方法能有效绘制包括甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌、甲状腺髓样癌等在内的各种甲状腺癌亚型的驱动突变谱。研究表明，标签扩增子深度测序技术能够检测血浆ctDNA中的超低频突变，灵敏度>97%，突变等位基因频率检测下限约为2%。此外，癌症个性化深度测序分析技术可对ctDNA进行定量分析。与评估肿瘤负荷、检测微小残留病和监测早期治疗反应的传统方法相比，它有几个优势。近年来，NGS技术已应用于内分泌肿瘤研究，关于甲状腺髓样癌的多项发现已发表，这些研究主要使用靶向测序策略，有些也使用全外显子组测序方法。虽然全外显子组测序和全基因组测序可以实现全基因组覆盖，但与靶向测序相比，其检测低频变异的灵敏度明显有限。总之，上述能够对ctDNA进行动态定量监测的高灵敏度检测技术，已成为检测甲状腺癌术后微小残留病和预测复发的重要潜在工具。
ctDNA的甲基化分析已成为多种癌症早期诊断、复发监测和预后评估的有效工具。由于健康个体中肿瘤抑制基因的启动子区域几乎完全未甲基化，因此检测CTC和ctDNA中的异常甲基化具有高度特异性。一项多中心研究显示，在甲状腺分化癌转移过程中，DNA甲基化发生渐进性去甲基化，在不同亚型的转移灶中观察到60%的甲基化趋同。根据原发肿瘤的156-CpG甲基化谱，可以准确预测远处转移风险。在某些研究中，它在检测微小残留病方面显示出比ctDNA突变分析明显更高的灵敏度。作为DNA甲基化分析最可靠的方法，亚硫酸氢盐测序能够在单核苷酸分辨率下进行精确定量。目前已开发了几种成熟的DNA甲基化分析技术，包括全基因组亚硫酸氢盐测序、简化代表性亚硫酸氢盐测序、靶向富集方法、甲基化CpG串联扩增测序和甲基化芯片。DNA甲基化分析的非亚硫酸氢盐转换方法包括抗体富集和限制性内切酶技术。在基于抗体的方法中，甲基化DNA免疫沉淀利用特异性识别5-甲基胞嘧啶的抗体选择性富集甲基化DNA片段，随后通过量化差异荧光强度来确定甲基化水平。值得注意的是，适用于游离DNA的细胞游离MeDIP和高通量测序在检测ctDNA甲基化模式方面表现出高灵敏度，能够有效识别和分类多种癌症类型。
集成PCR和RNA测序技术的微流控系统广泛用于检测基因突变。其中，最近报道的高通量单细胞RNA测序微流控系统允许并行分析大量样本。此外，具有多种检测功能的微流控平台可以同时分析多个遗传靶点，从而显著提高检测效率。Ou等人开发了集成液滴数字检测系统，以进一步提高检测通量。该系统将微流控液滴分割和多重PCR反应与快速、三维、大体积液滴扫描计数技术相结合。在突变等位基因检测中，该系统表现出100%的特异性，灵敏度范围在0.00125%至0.005%之间，假阳性率为0%。为了实现ctDNA的高灵敏度检测，研究人员开发了一种包含40,192个微孔并具有双向样本入口区域的微流控PCR芯片。该芯片可以检测到低至0.01%的变化。相比之下，Yu等人设计了一种基于自分离滑动原理的芯片。其“链珠”连续微流控通道能够自发产生液滴。这个简单的平台不需要复杂的通道设计或外部泵阀系统，易于操作。由于ctDNA半衰期短，在早期癌症中丰度极低，其检测面临独特挑战。研究人员开发了一种超灵敏电化学生物传感器，可快速检测全血中的ctDNA。DNA修饰的金包覆磁性纳米颗粒传感器可以特异性识别短链和长链DNA靶标。此外，它可以在20分钟内检测全血中的ctDNA，为早期甲状腺癌诊断提供了一种新的、高灵敏度、微创的策略。
在临床意义上，ctDNA分析为甲状腺癌的分子分型提供了非侵入性基础。在甲状腺癌病例中，BRAF基因是最常发生突变的，突变率约为76.0%。其次是RET重排和RAS驱动突变。BRAFV600E突变因其在甲状腺癌中的高特异性及其作为分子靶向治疗靶点的作用，是一种非常有价值的液体活检生物标志物。BRAFV600E在甲状腺未分化癌和甲状腺乳头状癌病例中的检出率分别为27.2%和35.7%。然而，在任何甲状腺滤泡癌病例中均未检测到。在血浆中检测到RET融合且肿瘤组织明确报告融合伴侣的样本中，基于液体活检和组织活检鉴定的融合伴侣一致性率为81%至89%，其中卷曲螺旋结构域包含6基因和核受体共激活因子4是最常见的RET融合伴侣。RAS突变在甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡癌中的检出率分别为18.5%、11.9%和62.5%。对涉及2552名甲状腺癌患者的17项研究的分析显示，RAS突变的总发生率为35.4%。其中，NRAS突变最为普遍，其次是HRAS和KRAS突变。
在预后风险分层方面，ctDNA动态监测揭示的全面突变谱已成为评估肿瘤转移潜力的最有前景的分子工具。ctDNA的遗传谱，特别是特定突变的组合，可作为强大的预后预测工具。BRAF突变与甲状腺乳头状癌的不良预后相关，并且常见于具有侵袭性、未分化表型的甲状腺未分化癌。伴有BRAFV600E突变的甲状腺乳头状癌通常与甲状腺分化标志物表达的显著减少相关。这使得癌症对放射性碘治疗更具抵抗力，并与较差的预后相关。遗传背景分析显示，rs2853669 TT基因型与甲状腺乳头状癌复发风险增加显著相关。然而，在TC/CC基因型背景下，这种关联无统计学意义。特别重要的是那些携带以下三种突变的患者：BRAFV600E、TERT启动子和rs2853669 TT。这些患者的复发率高达76.5%。相比之下，既无这些突变又有TC/CC基因型的患者复发率仅为8.4%。这两组之间的复发风险存在显著差异。一项对11项甲状腺乳头状癌研究的荟萃分析表明，基于ctDNA的BRAFV600E突变检测的诊断性能如下：合并灵敏度为56%，特异性为91%，诊断比值比为12。BRAFV600E突变有望成为监测晚期甲状腺癌疾病进展的工具。值得注意的是，RAS突变的存在与甲状腺癌患者远处转移和死亡风险增加显著相关，表明它们可能作为预后标志物。TP53突变在甲状腺分化癌中不常见，但在甲状腺未分化癌中明显更为普遍。来自日本的研究数据显示，甲状腺未分化癌患者中TP53突变的检出率显著高于晚期非甲状腺未分化癌患者。
在治疗指导和监测方面，ctDNA的核心价值在于其能为靶向治疗提供依据，并实现治疗疗效的动态评估。ctDNA水平的纵向定量监测是监测动态治疗反应的最有前景的方法，这归因于其半衰期短，能够近乎实时地反映肿瘤负荷的变化。ctDNA的核心临床意义在于其能为靶向治疗提供基础。研究表明，BRAFV600E驱动突变常见于甲状腺分化癌和甲状腺未分化癌，针对该突变的BRAF抑制剂已显示出临床疗效。此外，甲状腺乳头状癌患者中RET基因改变的检出率为10-20%，而在甲状腺髓样癌患者中，检出率几乎为100%。为了应对检测甲状腺癌中罕见NTRK基因融合的挑战，专家建议使用基于NGS的DNA/RNA测序对晚期、不可切除、高风险或放射性碘难治性疾病的患者进行初步筛查。阳性结果可以直接指导使用原肌球蛋白受体激酶抑制剂。这凸显了ctDNA融合检测等液体活检技术在无创识别符合靶向治疗条件的患者方面的关键价值。
分析早期癌症ctDNA的挑战源于其半衰期短和丰度极低。甲状腺癌中ctDNA检出率低可能与肿瘤增殖活性、体积和组织学亚型有关。研究证实，肿瘤增殖指数与ctDNA检测灵敏度呈正相关，而甲状腺分化癌通常处于低增殖状态，这直接解释了这一现象。与其他实体瘤相比，甲状腺癌的ctDNA检出率明显较低。例如，胃癌研究报道的ctDNA检出率为7.7%，超过了组织活检2.6%-4.4%的检出率。相比之下，甲状腺癌尚未达到可比的检测水平。
检测的灵敏度和广度受到技术限制。组织检测仍然是大多数癌症分子分型的金标准，因为ctDNA检测识别融合事件和拷贝数变异的能力有限。然而，在临床需要快速结果或组织活检不可行的情况下，ctDNA检测可作为常规替代方法。尽管ctDNA能够检测甲状腺癌的基因组突变，但传统方法在低丰度样本中容易出现假阴性。与传统方法相比，基于微流控系统的集成核酸分离和分析技术目前在成本效益、污染控制和处理速度方面具有优势。然而，该技术通常非特异性提取多种核酸，这可能会影响样本的代表性。因此，有必要建立标准化的样本收集和处理程序，以构建可靠、高效的微流控平台。尽管当前研究主要集中在开发检测功能单元上，但集成ctDNA提取和检测的微流控芯片，特别是基于数字PCR的芯片，仍然很少。
尽管ctDNA甲基化谱有望作为液体活检生物标志物，应用于甲状腺癌的早期检测、治疗监测和预后预测，但仍缺乏临床验证的可靠证据。一项对22例局限性甲状腺乳头状癌患者的小样本研究表明，术前检测ctDNA的效能有限，其与术后预后的相关性仍有待确定。由于生物学异质性和技术限制，其在甲状腺癌中的临床价值仍不明确，特别是在原发性甲状腺乳头状癌方面，尚无足够证据支持其应用。即使在无远处转移的甲状腺乳头状癌患者中，ctDNA的预后预测价值仍不清楚，这表明其释放可能受肿瘤微环境或代谢重编程的调节。此外，其他限制包括：确保技术重现性和控制批次效应的困难、多中心验证数据的缺乏、复杂的操作流程和每个样本的高昂成本、早期癌症中ctDNA丰度极低导致的固有低信噪比，以及当前缺乏标准化的检测框架。这些挑战通常通过现有检测方法解决，这些方法需要极高的测序深度，从而显著增加了检测成本。新兴技术，如嘧啶依赖性紫外小等位基因富集，提高了检测灵敏度，但与程序标准化和成本控制相关的问题仍然存在。
ctDNA作为甲状腺癌生物标志物的临床验证仍处于起步阶段，主要证据来自回顾性队列研究和针对特定亚型的研究。ctDNA最有前景的最新应用包括早期检测侵袭性、高死亡率的甲状腺未分化癌的疾病进展或复发，从而为及时调整治疗策略提供可能。在晚期或难治性甲状腺癌中，当组织样本无法获取或不足时，ctDNA可作为识别可靶向基因改变的补充方法，从而指导精准治疗。手术切除后，特别是在高危患者中，该方法用于评估微小残留病状态，目的是识别具有高复发风险的患者。然后利用这些信息来指导辅助治疗决策或加强监测。通过纵向监测ctDNA水平的动态变化，可以比传统影像学更早地提示治疗反应或耐药，从而促进治疗方案的实时调整。
然而，与组织活检相比，ctDNA检测在甲状腺癌中的敏感性和特异性需要通过更大规模的前瞻性研究进行广泛验证。ctDNA检测的技术复杂性和高昂费用限制了其在常规临床实践和筛查项目中的广泛应用。目前缺乏强有力的成本效益分析数据。此外，甲状腺癌中的ctDNA释放水平——尤其是在早期或低负荷疾病中——可能很低，这对检测技术的灵敏度提出了极高的要求。肿瘤的时空异质性也可能损害ctDNA检测的代表性。目前，缺乏ctDNA样本收集、储存、处理和分析的标准化方案。这给不同平台和检测方案之间结果的比较带来了挑战。对于低水平ctDNA或阴性结果的解读，特别是在肿瘤负荷低的情况下，迫切需要制定更清晰的临床指南。
外泌体
外泌体是纳米尺寸的双膜囊泡。它们由所有细胞类型普遍分泌，通过多囊体的胞吐作用释放到细胞外空间和循环中，并普遍存在于所有体液中。其可及性使外泌体成为极具吸引力的液体活检生物标志物，便于纵向监测疾病进展。研究表明，肿瘤细胞的外泌体分泌量显著高于正常细胞，甚至高达10倍。外泌体在液体活检中的诊断潜力优于ctDNA和CTC，具体体现在其丰度远高于CTC，并且它们携带的RNA、DNA
