随着工程纳米材料在工业和消费品中的广泛应用，评估其在环境中的归趋、生物积累潜力和生态风险变得至关重要。银纳米颗粒因其抗菌特性而被广泛使用，但在环境中可能释放出毒性更强的银离子，因此准确区分和量化生物组织中的纳米银颗粒与溶解态银具有重要意义。单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP-ICP-MS）是检测和定量组织中金属纳米颗粒的有力工具。然而，该技术的广泛应用一直受到两大关键因素的限制：一是缺乏针对复杂基质中纳米颗粒提取和溶解的有效标准操作流程，二是缺乏合适且经过认证的生物参考材料。目前，许多研究依赖“加标回收”实验来验证分析方法，但这种方法存在明显缺陷，它绕过了组织基质自身是否能有效分解以释放纳米颗粒这一核心问题，也无法模拟纳米颗粒在生物体内可能发生的转化。为了支持可靠的分析方法验证，亟需能够反映纳米颗粒在生物组织内真实赋存状态的参考材料。
为了制备用于银纳米颗粒的鱼类组织内部参考材料，并评估制备过程中的关键步骤，研究人员开展了一项研究。研究采用心脏灌注法，将银纳米颗粒引入虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的循环系统，之后收集鳃和肝脏作为目标组织。通过对比灌注与未灌注组，以及不同组织处理步骤的效果，系统地评估了所制备参考材料的均匀性、稳定性及分析数据的质量。这项研究发表在《Environmental Science: Nano》期刊上。
研究人员采用了几个关键的技术方法。首先，通过心脏灌注技术将Ag NPs引入成年虹鳟鱼的循环系统，模拟了纳米颗粒在组织中的分布。其次，利用刀片式研磨机和后续的球磨两步法对收集的组织进行深度均质化处理。之后，采用四甲基氢氧化铵对组织样品进行消解/溶解，以释放Ag NPs形成悬浮液。最后，运用单颗粒电感耦合等离子体质谱对消解液进行高灵敏度分析，获取颗粒数量浓度、质量浓度和粒径分布等关键参数。整个分析过程在ISO 9001认证的质量管理体系下进行，并使用DOLT-5（Dogfish liver）标准物质对总银含量测定的准确性进行了验证。
证实了灌注器官中存在Ag NPs
通过SP-ICP-MS分析，确认了灌注的Ag NPs成功进入了虹鳟鱼的鳃和肝脏组织。在Ag NP处理组中，测量到的颗粒质量浓度高达数百μg g−1，明显高于未处理的对照组，这表明灌注有效地将Ag NPs输送并留存在了目标组织中。颗粒主要存在于细胞外空间，这为开发内部参考材料提供了有利条件，因为它避免了细胞内颗粒可能发生的溶解等问题。
研磨是制备用于测定颗粒指标样品的关键步骤
研究表明，样品均质化是制备高质量生物参考材料的关键。仅使用刀片研磨机处理组织后，测得的数据变异性较大。而增加球磨步骤后，数据质量得到了显著改善。例如，在肝脏中，Ag NPs的颗粒数量浓度从研磨前的10.7 ± 4.4 × 109particles g−1提高到研磨后的15.9 ± 1.4 × 109particles g−1，同时测量的精密度也大幅提升，相对标准偏差（RSD%）从40.7%降至9.1%。所有颗粒参数在联合使用刀片研磨和球磨后，其RSD值均低于15%。重要的是，研磨过程没有改变Ag NPs的粒径分布，这表明增加的颗粒信号源于更有效地释放了原本与更大细胞聚集体结合的Ag NPs，而非颗粒本身的破碎。
评估了Ag NPs测量结果的可靠性
通过比较SP-ICP-MS测得的颗粒银质量浓度与传统酸消解法测得的总银含量，研究人员进行了质量平衡评估。对于Ag NP灌注的鳃和肝组织，两种方法测得的值在统计学上无显著差异（UΔM> ΔM），表明测量结果是可靠的。同时，对DOLT-5标准物质的验证也证明了总银含量分析流程的准确性。这为所制备的内部参考材料的表征提供了可靠证据。
对照组织中存在痕量纳米银
即使在未灌注Ag NPs的对照组鱼组织中，也检测到了纳米级的银颗粒。其可能的来源包括背景污染、环境暴露，或生物成因转化（如鱼体在高pH肠道环境中将溶解银转化为氧化银颗粒）。尽管背景浓度（0.2–0.7 × 109particles g−1）远低于处理组，但它为评估处理效果提供了必要的基线，并提示在研究纳米银的生物积累时，背景本底是需要考虑的因素。
使用纳米材料时灌注技术的考量
研究人员指出，灌注过程中使用的生理盐水可能导致Ag NPs发生一定程度的团聚，这从SP-ICP-MS测得的颗粒粒径（74–81 nm）大于原始颗粒（约57 nm）中可以看出。尽管如此，颗粒尺寸仍远小于鱼类肝脏血管的直径，不会阻碍灌注。这项研究证明了灌注技术适用于Ag NPs，但未来需要验证其在其他纳米材料（如二氧化钛、氧化锌）上的适用性，并评估延长超声处理等步骤对提高回收率或减少团聚的效果。
总而言之，这项研究成功开发了一种利用心脏灌注法结合两步组织均质化工艺，制备含有银纳米颗粒的鱼类组织内部参考材料的方法。该方法流程简单、成本效益高，能够生产出均质、可重现的参考材料，显著提升了使用SP-ICP-MS测量生物组织中纳米颗粒的精确性和稳定性。其重要意义在于，它为验证复杂生物基质中纳米颗粒的分析方法提供了一个更贴近真实暴露场景的实用工具，有效弥补了传统“加标回收”实验的不足，为支持纳米材料的监管测试、生态风险评估和环境监测提供了坚实的方法学基础。未来的工作将集中于评估该参考材料的长期储存稳定性（保质期），开展实验室间的比对测试，并将该方法推广至更多类型和更低积累水平的纳米材料，以扩展其应用范围。
