在生命科学探索微观世界奥秘的征程中，科学家们一直渴望“看见”细胞内部更精细的结构与动态。传统的荧光显微镜受限于光的衍射极限，分辨率被限制在200纳米左右，难以分辨许多亚细胞结构。单分子定位显微术（Single-molecule localization microscopy, SMLM）的出现打破了这一桎梏，它通过分析单个荧光分子随机发光与定位，最终合成一幅超高分辨率的图像，将分辨率提升至纳米级别。然而，科学探索的脚步从未停歇。研究人员希望能在获得超高空间分辨率的同时，还能获取每个荧光分子的“光谱指纹”——即其发射光谱，这就是谱学单分子定位显微术（spectroscopic SMLM, sSMLM）。sSMLM能将不同发射光谱的荧光分子区分开，从而实现对多种生物分子的同时成像（多重成像），这对于理解复杂的生命过程至关重要。
但理想很丰满，现实很骨感。早期的sSMLM技术面临一个根本性难题：光子不够用。每个荧光分子在其“一生”中只能发射有限数量的光子。为了同时获取空间位置和光谱信息，传统方法（如使用衍射光栅）需要将宝贵的光子“分拆”到不同的探测通道中。例如，一部分光子用于确定分子位置（零级衍射），另一部分用于分析其光谱（一级衍射）。这种“分家”的做法导致用于空间定位和光谱分析的光子数都减少了，其直接后果就是定位精度和光谱精度的双双下降。这就像用一半的像素去拍一张高清照片，清晰度必然大打折扣。如何在有限的光子“预算”内，最大化地利用每一个光子，同时提升空间和光谱的测量精度，成为推动sSMLM技术发展，实现高质量多重超分辨成像的关键挑战。
为了解决这一核心挑战，一项发表在《npj Imaging》上的研究提出了一种创新性的光学设计方案。研究人员不再“分拆”光子，而是设法“复制”并高效利用它们。他们开发了一套名为“对称色散双楔棱镜”（symmetrically dispersed dual-wedge prism, SDDWP）的sSMLM系统。这项研究的核心思想颇具巧思：它使用一个分束器将来自单个荧光分子的发射光束一分为二，然后让这两束光分别通过一个结构相同的双楔棱镜（dual-wedge prism, DWP）。每个DWP都会对光束产生色散，将不同波长的光在空间上分开，形成所谓的“-1级”和“+1级”光谱通道图像。关键在于，这两个图像是“对称”的，它们包含了互补且完整的信息。通过后续的计算分析，可以联合利用这两个通道中的所有光子，来精确反推出荧光分子原本的空间位置和发射光谱。简单来说，以前是用一部分光子干一件事（定位或测光谱），现在是用全部光子（分布在两个对称通道中）同时干好两件事，从而实现了光子利用率的最大化。
为了开展这项研究，作者综合运用了先进的光学工程、理论模拟和生物成像实验。主要关键技术方法包括：1. SDDWP光学模块设计与集成：设计并制作了包含分束器、直角棱镜和双楔棱镜的紧凑型模块，该模块可直接安装在倒置显微镜的相机端口，实现从传统SMLM到sSMLM的便捷升级。2. 精密校准技术：利用纳米孔阵列样品和可调谐激光光源，对系统的空间定位、光谱色散以及轴向（三维）定位进行了精细校准，建立了从原始图像数据中提取位置、波长和深度信息的数学模型。3. 高性能成像与计算分析：使用科研级sCMOS相机同时采集两个光谱通道的图像序列，并利用ThunderSTORM等软件进行单分子定位与拟合。开发了定制算法来匹配两个通道中的定位点，并联合计算其空间坐标、发射光谱峰值波长（λ）和轴向位置（z）。4. 生物样本验证：使用固定的人宫颈癌细胞（HeLa细胞），通过免疫荧光标记技术，用发射光谱高度重叠的远红染料（DY-634, Alexa Fluor 647, CF660C）分别标记过氧化物酶体、微管和线粒体，在单次红光激发下进行多重三维超分辨成像。5. 高密度单粒子追踪模拟与验证：通过模拟和实验，使用具有固有光谱异质性的量子点，验证了SDDWP系统在超高粒子浓度下进行基于光谱标记的平行单粒子追踪的能力。
研究结果
验证2D SDDWP-sSMLM
研究人员首先在二维成像模式下验证了SDDWP相比之前DWP-sSMLM的改进。理论模拟与实验测量高度吻合。在光子数为1000时，SDDWP的空间定位精度达到6.0 nm，比DWP-sSMLM的8.5 nm提升了29%。在光谱精度方面，SDDWP的优势更加明显，在2000光子时，光谱精度从DWP的0.28 nm提升至0.16 nm，提升了45%。对多种荧光染料（DY-634, AF647, CF660C, CF680）的成像显示，SDDWP能显著缩小拟合光谱峰的半高宽（平均减少39%），并将荧光团之间的光谱误分类率从27%降低到11%，极大地改善了荧光团的区分能力。
3D SDDWP-sSMLM性能分析
将SDDWP与双平面（biplane）成像法结合，即可实现三维超分辨成像。理论分析表明，在±248 nm的有效成像深度内（轴向精度优于50 nm），3D SDDWP的平均空间定位精度为10.1 nm，比3D DWP的13.7 nm提升了27%；其平均光谱精度为0.5 nm，比3D DWP的1.0 nm提升了48%。这证实了SDDWP设计在三维成像中同样能带来显著的性能提升。
用3D SDDWP-sSMLM进行细胞成像
研究团队在真实的生物样本上展示了该技术的实用性。他们用SDDWP-sSMLM对HeLa细胞进行了三重标记成像：用DY-634标记过氧化物酶体，AF647标记微管，CF660C标记线粒体。尽管这三种染料的发射光谱严重重叠，但SDDWP系统成功实现了对三种细胞器的清晰区分和三维可视化。深度编码和颜色编码的重建图像显示，线粒体跨越了较大的深度范围，而微管结构则集中在更浅的深度区域，过氧化物酶体也被准确地定位和显示。不同通道之间的串扰很低，验证了SDDWP在复杂生物样本中进行高精度多重三维成像的能力。
大规模平行单粒子追踪
光谱信息的加入极大地增强了单粒子追踪的准确性。在模拟实验中，对于三条运动轨迹交叉的粒子，仅凭空间信息进行关联的错误率高达90%。加入DWP提供的光谱信息后，错误率降至53%。而使用精度更高的SDDWP系统，错误率进一步骤降至3%。在实验验证中，研究人员对悬浮在甘油中的665 nm量子点进行了追踪。量子点本身因尺寸差异具有固有的光谱异质性，这为每个粒子提供了独特的“光谱标签”。结果显示，在引入光谱信息后，追踪轨迹的准确性大幅提高，轨迹内部的光谱变化显著减小。更重要的是，SDDWP-sSMLM能够实现超高密度下的粒子追踪，其成功追踪的粒子密度达到了约0.275个/微米2，比之前报道的研究提高了约五倍，接近理论密度极限。
研究结论与意义
本研究成功开发了基于对称色散双楔棱镜的三维谱学单分子定位显微系统。其核心创新在于通过对称的光路设计，对单分子荧光发射的光子进行均分和对称色散，并联合分析两个通道中的所有光子，从而最大限度地利用了有限的光子预算。与之前未采用联合分析的方法相比，该系统将空间定位精度和光谱精度分别提升了27%和48%，达到了9.0 nm的横向定位精度、18.1 nm的轴向定位精度和0.4 nm的光谱精度。
这项工作具有多重重要意义。首先，在技术层面，SDDWP模块作为一个紧凑的相机端口附加组件，集成了高光子效率、高稳定性和易用性，可以方便地将现有的常规SMLM系统升级为高性能的sSMLM系统，降低了该技术的应用门槛，有利于其在更广泛的研究社区中推广。其次，在科学应用层面，它为实现高质量、高效率的多重三维超分辨成像提供了强大工具。研究人员仅用单一红色激发激光，就成功对光谱高度重叠的三种远红染料标记的不同细胞器进行了同时成像，这为研究细胞器互作、生物大分子共定位等复杂生物学问题提供了新的视角。最后，其所展示的高密度、基于光谱标记的大规模平行单粒子追踪能力，为研究细胞内部或体外环境中纳米颗粒、病毒、蛋白质分子等的高通量动态行为打开了新局面，有望在生物物理学、纳米技术和药物递送等领域产生重要影响。
尽管该技术在处理发射光谱极度接近的荧光团时仍存在固有挑战，并且在低光子数下精度会下降，但通过精心的实验设计可以有效缓解这些问题。总体而言，3D SDDWP-sSMLM作为一种强大的新型成像工具，为在纳米尺度上探索细胞内的复杂相互作用和分子动力学奠定了坚实的基础。
