高效地将螯合剂与IgG结合，并准确测定螯合剂与IgG的摩尔比

时间：2026年4月1日

来源：Applied Radiation and Isotopes

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蛋白质螯合剂共价结合的高产率测定方法及优化策略。摘要：通过无水DMSO制备储存液和干手操作技术，建立了高重复性和高收率的DOTA-NHS、CHX-A”-DTPA与IgG共价结合方法，并开发了Y(III)-Arsenazo III显色法测定摩尔比的新技术，解决了苯环结构对280nm吸光度测定的干扰问题。

日本千叶县柏市柏西町163-1，慈惠会大学医学院医学科学研究中心医学工程部

摘要

螯合剂缀合是蛋白质金属离子标记的关键步骤，所得蛋白质-螯合剂缀合物的螯合剂与蛋白质（螯合剂/蛋白质）摩尔比对其功能有重要影响。因此，控制和测量螯合剂与蛋白质的摩尔比是重要的技术考虑因素。在现有的螯合剂/蛋白质测定方法中，使用Y(III)–Arsenazo III试剂的比色法较为便捷，因为它既不需要大型设备也不需要昂贵仪器。我们使用这种测定方法研究了三种代表性的螯合剂（DOTA-NHS、DTPA-di和CHX-A”-DTPA）。对于螯合剂与蛋白质的缀合反应，高产率和可重复性是理想的。然而，已报道的产率差异很大，目前尚未建立标准化的高产率且可重复的程序。

我们建立了新的测定方法，以确定DOTA-NHS和CHX-A”-DTPA与蛋白质的摩尔比，使用人IgG作为目标蛋白质进行缀合。我们还建立了一种能够获得高缀合反应产率的程序。通过这两种方法——在无水DMSO中制备螯合剂储备溶液以及在整个缀合过程中采用“干处理技术”——我们成功实现了高重复性和高产率。

引言

螯合剂化合物是重要的化学物质，在医学诊断和治疗中作为金属离子的配体（Caravan等人，1999；Kubíček等人，2009；Lauffer，1987；Meares等人，1984）。例如，螯合剂DTPA（二乙撑三胺五乙酸；其化学结构见图1）及其衍生物已被广泛用于研究和临床应用（Arano等人，1996；McLarty等人，2009；Scollard等人，2011；Tang等人，2005）。同样，螯合剂DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸；其化学结构见图1）及其衍生物也因具有比DTPA更高的配位亲和力而被广泛使用（Caravan等人，1999；Kubíček等人，2009；Lauffer，1987；Wedeking等人，1992）。DOTA的这种较高配位亲和力归因于其环状化学结构。用于成像诊断的代表性金属离子包括⁶⁷Ga、^99mTc和¹¹¹In，而⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu和²¹¹At则用于基于放射性核素的疗法。此外，Gd在低分子量螯合剂中的配位结构中用作MRI阳性造影剂。

为了进行涉及金属离子的医学诊断和治疗，医疗从业者使用由蛋白质、螯合剂和金属离子组成的缀合物。制备这些缀合物的第一步是将螯合剂化合物与目标蛋白质缀合。为了避免蛋白质变性，这种缀合反应必须在纯水缓冲液或含有少量可与水混溶的有机溶剂（如乙醇和DMSO）的水缓冲液中进行。因此，这种类型的缀合反应产率通常远低于在有机溶剂中进行的标准有机化学反应的产率。产率较低的原因在于，用于缀合的活性化学物质（如N-羟基琥珀酰亚胺酯、酸酐和苯基异硫氰酸酯）不仅与蛋白质的伯氨基反应，还与水缓冲液中的氢氧根离子（OH^-）反应。此外，这些缀合反应在较高pH值下更易进行，因为只有伯氨基的未质子化形式（–NH2）才能与这些活性化学物质反应。这解释了为什么报道的螯合剂化合物的反应产率通常较低，一般在2%到15%以下（Abadi等人，2021；Alirezapour等人，2013；Arano等人，1996；Hoppman等人，2011；Sudo等人，2023；Winter等人，2023）。螯合剂与蛋白质缀合的另一个潜在问题是反应产率的可重复性差。大多数已发表的论文仅报告了一个反应产率值，据我们所知，没有论文探讨和报告过产率的可重复性。

在之前关于螯合剂与蛋白质缀合的论文中，报道了多种实验程序，包括不同类型的缓冲液、pH值、温度以及螯合剂和蛋白质的浓度等。因此，包括本研究作者在内的许多读者难以确定哪些反应条件是最优的。在本文中，我们旨在确定影响螯合剂与蛋白质缀合的几个实验因素，并提出了一种简单且可重复的程序，以实现高产率。

在现有的螯合剂/蛋白质测定方法中，使用Y(III)–Arsenazo III试剂的比色法较为便捷，因为它既不需要大型设备也不需要昂贵仪器。此外，Y(III)–Arsenazo III试剂可用于多种螯合剂的比色测定，包括DOTA、DTPA和DFO（去铁胺甲磺酸盐）。我们使用人IgG作为这些螯合剂的目标蛋白质，研究了这种测定方法对三种代表性螯合剂（DOTA-NHS、DTPA-di和CHX-A”-DTPA；其化学结构见图1）的效果。在我们的研究中，我们发现IgG的浓度以依赖性方式影响了该比色测定，这是由于IgG与Y(III)–Arsenazo III试剂的相互作用，而之前的文章并未报道或研究过这一影响。因此，我们的研究对于正确测定IgG-螯合剂缀合物的螯合剂与蛋白质（螯合剂/蛋白质）摩尔比非常有价值。

众所周知，DOTA及其衍生物对金属离子的配位亲和力高于DTPA及其衍生物。这种优越的亲和力是DOTA基螯合剂相对于其他类型螯合剂的重要优势。然而，金属离子与DOTA及其衍生物形成复合物的配位反应比与其他类型螯合剂（如DTPA及其衍生物）的相应配位反应慢得多。DOTA基螯合剂的相对缓慢动力学不仅阻碍了金属离子作为成像标记物和治疗剂的配位反应，还给通过Y³⁺基比色剂（Y(III)–Arsenazo III复合试剂）测定螯合剂浓度带来了技术问题。因此，我们研究了反应温度和反应时间，以优化与人IgG作为模型蛋白质的DOTA部分的比色测定。

在测量CHX-A”-DTPA基IgG-螯合剂的螯合剂与IgG（螯合剂/IgG）摩尔比时，我们遇到了另一个技术问题。这种螯合剂的化学结构中含一个苯环，由于该环在280 nm处有吸收（A280），可能会显著干扰IgG浓度的A280测量。为了解决这个问题，我们采取了三个步骤：（1）合成了一个模拟CHX-A”-DTPA部分与IgG缀合的模型化合物；（2）估计了该模型化合物对280 nm处吸收的贡献；（3）获得了IgG-CHX-A”-DTPA缀合物的真实螯合剂/IgG摩尔比值。

化学物质

我们通过东京化学工业有限公司（日本东京）的有序合成获得了螯合剂化合物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单-N-羟基琥珀酰亚胺酯（DOTA-NHS，图1），该化合物含有N-羟基琥珀酰亚胺酯活性基团。我们还从东京化学工业有限公司购买了两种市售螯合剂化合物：二乙撑三胺五乙酸（DTPA，图1）和二乙撑三胺五乙酸二酐（DTPA-di，图1）。

DOTA比色测定的反应条件优化

我们首先使用Y(III)–Arsenazo III溶液进行了DOTA的比色测定（DOTA的化学结构见图1）。在进行此测定时，我们仔细参考了之前关于DTPA衍生物的研究中报告的反应条件（Pippin等人，1992）。如图2a所示，经过10分钟的室温反应后，1 μM DTPA（红线）的A652值显著低于仅使用Y(III)–Arsenazo III溶液的对照组（黑线）。

讨论

涉及螯合剂的缀合反应是蛋白质金属离子标记的关键步骤。这种标记方法允许在动物实验和人类临床实践中进行蛋白质生物分布分析和药代动力学分析。此外，金属离子标记还可以赋予蛋白质重要的抗癌细胞毒性功能。在这些实验和临床应用中，化学缀合反应需要简单的程序、高产率和高的

结论

在本研究中，我们研究了三种螯合剂（DOTA-NHS、DTPA-di和CHX-A"-DTPA）与人IgG的缀合，并使用Y(III)–Arsenazo III试剂的比色方法测量了IgG-螯合剂的螯合剂/IgG摩尔比。对于DOTA-NHS和CHX-A"-DTPA，我们利用这种比色方法建立了新的方法来准确测定螯合剂/IgG摩尔比。此外，我们还成功获得了高反应产率和高

CRediT作者贡献声明

辻淳：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、项目管理、方法学。大田宏树：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、方法学。松村康宏：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、方法学、调查、概念化。横山雅之：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、概念化。