一种集成了免疫反应功能的ACRCA微芯片与用于检测微量诺如病毒抗原的RCA技术

时间：2026年4月1日

来源：Biosensors and Bioelectronics

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本研究基于电化学微芯片平台开发抗体耦合环介导扩增（ACRCA）策略，实现单分子水平特异性抗原-抗体检测，检测限达10fg/mL，并成功区分诺如病毒与其他食源性病毒。该技术兼具高灵敏度、便携性和定量分析能力，适用于疾病诊断、抗体筛选及器官oid研究。

上海交通大学医学院上海病毒学研究所，中国上海市天雄路166号，200240

摘要

蛋白质检测在疾病的早期诊断和治疗效果评估中起着关键作用。然而，它一直面临着单分子水平灵敏度的挑战，缺乏像核酸那样的信号放大能力。在这里，我们基于电化学微芯片平台建立了一种极其强大的抗体偶联滚环扩增（ACRCA）策略。该方法通过单管反应中的指数级RCA扩增实现特异性抗原-抗体检测信号，然后由敏感的电化学微芯片进行定量读取。为了验证其性能，我们将该技术应用于食品borne诺如病毒（NoV）抗原的超灵敏检测。令人惊讶的是，我们发现线性检测范围为10 fg/mL至100 pg/mL，检测限为10 fg/mL（0.169 fM）。此外，可以明显区分NoV与其他食品borne病毒（HAV、HEV和RV）。ACRCA-微芯片或其升级版本（用于高通量检测）在疾病诊断、抗体筛选和类器官研究方面具有巨大潜力。

引言

核酸和蛋白质是生物学中心法则的两个核心要素，在疾病的发病和进展中起着关键作用。因此，这两种常见的分子也是传染病、肿瘤、阿尔茨海默病（AD）等疾病的早期诊断和治疗效果评估的重要目标（Dong等人2023；Guo等人2024a；Hu等人2024）。核酸检测采用聚合酶链反应（PCR）作为基本原理，包括温度依赖性PCR（实时PCR、嵌套PCR、逆转录PCR等）和等温PCR（LAMP、RCA、RPA、SDA、HAD、MDA等）（Budd等人2023；Li等人2021；Petralia和Conoci 2017；Qin等人2025；Shi等人2025），这两种方法都可以放大目标核酸以增强检测信号（达到单分子水平）。蛋白质检测包括非特异性方法（双缩脲反应、紫外吸收光谱、凯氏定氮法、酚试剂法、比色测定、质谱和蛋白质电泳等）以及特异性免疫技术（如Western Blot、IFA等）（Brandmeier等人2023；Choi等人2025；Fan等人2023）。由于缺乏信号放大能力，非特异性蛋白质检测方法仅在特定情况下使用，很少用于快速疾病诊断（Gul等人2025；Krainer等人2024；Li等人2025b）。基于抗原-抗体免疫反应的蛋白质检测方法由于具有高特异性，被广泛用于快速疾病诊断。然而，蛋白质检测方法在信号放大方面始终无法与核酸检测技术相媲美（Li等人2023）。

尽管开发的核酸检测技术具有基于核酸序列配对的高度信号放大能力和高特异性，但核酸仅携带疾病的遗传信息（Li等人2025a）。相比之下，蛋白质是具有生物活性的分子，可以指示疾病的进展状态（Cohen和Walt 2019）。因此，核酸检测不能完全替代蛋白质检测。为了提高蛋白质检测的灵敏度，已经为实验室检测和即时检测（POCT）两种主要检测场景开发了各种信号放大策略（Flynn等人2023；Klebes等人2024）。对于实验室检测，经典的酶联免疫吸附测定（ELISA）使用酶生成特定的化学物质，然后通过检测器检测其光谱（达到ng/mL水平）（Yi等人2025）。流式细胞术通过将荧光信号转换为放大的电信号（达到pg/mL水平）来实现比ELISA更高的灵敏度。近年来，流行的化学发光检测技术通过电极驱动的化学发光信号放大抗原-抗体反应，进一步提高了灵敏度（达到fg/mL水平）。尽管这些实验室方法具有高灵敏度和定量分析能力，但它们都依赖于昂贵的仪器、繁琐的操作和训练有素的技术人员（Banakar等人2022）。对于POCT，流行的侧向流动测定（LFA）使用胶体金作为指示信号（μg/mL至ng/mL水平）（Quesada-Gonzalez和Merkoci 2015；Thanh 2025）。几分钟内，可以通过视觉颜色变化确定测试结果。此后，胶体金被许多新型指示标签所取代，如量子点、贵金属纳米簇、纳米酶和磁性纳米颗粒。通过使用便携式设备读取这些新标签的信号，检测灵敏度提高了数倍。这些LFA检测方法具有低成本、易用和便携性等优点（Aizpurua-Olaizola等人2018；Dong等人2024；Dong等人2025；Guo等人2024b；Sena-Torralba等人2022；Wang等人2021）。然而，较低的灵敏度和有限的检测能力不容忽视。此外，电化学传感技术代表了另一种有前景的非LFA POCT方法，具有多检测能力、低成本、便携性和定量分析（达到ng/mL水平）等优点（Sena-Torralba等人2022）。与实验室检测技术相比，电化学传感方法在性能提升方面仍有潜力。

在这里，我们提出了一种基于电化学微芯片的抗体偶联滚环扩增（ACRCA）方法，以显著提高蛋白质检测的灵敏度（图1）。为了评估该方法的性能，我们使用诺如病毒（NoV）抗原作为模型。首先，在电化学工作电极上修饰一种针对NoV抗原的捕获抗体。接下来，另一种配对的检测抗体装饰有RCA引物。当两种特异性抗体都与NoV抗原结合时，RCA引物同时启动核酸扩增。电化学工作电极上的RCA扩增会引发电化学信号变化，随后通过电化学芯片的差分脉冲伏安法（DPV）进行检测。

材料

本研究中使用的试剂和材料包括：1H,1H,2H,2H-十七氟癸基三甲氧基硅烷（FAS-17，Alfa Aesar，美国），甲苯和无水乙醇（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.，中国），甘油（Macklin，中国），磷酸盐缓冲盐水（PBS，Yeasen，中国），半胱胺（Macklin，中国），戊二醛（Macklin，中国），甘氨酸（Bairui Biotechnology，中国），4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Solarbio，中国），乙二胺四乙酸（EDTA）

电化学芯片的功能修饰

检测诺如病毒抗原的电化学反应主要发生在电化学微芯片的工作电极上。因此，在工作电极上固定捕获抗体至关重要。电化学微芯片的三个电极（工作电极、对电极和参比电极）是在玻璃基底上制造的（图S1，支持信息），电极之间的狭窄区域是玻璃基底

结论

总之，我们基于电化学微芯片开发了一种抗体偶联滚环扩增（ACRCA）策略，用于高灵敏度蛋白质检测。这种方法最关键的特点之一是检测抗体装饰有RCA引物。RCA引物和适配体是在单一核酸序列上合成的。特异性针对IgG Fc区域的适配体位于整个核酸序列的5'末端。

CRediT作者贡献声明

Fucheng Wang：研究。 Qichong Xie：研究。 Yi Guan：监督、项目管理、资金获取。 Xiao Zhi：写作 - 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。 Pengda Wei：写作 - 原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据管理。 Yang Sun：写作 - 审稿与编辑、写作 - 原始草稿、研究