随着全球对植物源生物活性物质的需求因对合成药物和可持续性问题的关注而激增，开发先进的代谢工程解决方案迫在眉睫。传统提取方法因产量低、季节性波动和环境足迹大而受限。本综述批判性地审视了可持续生产策略，这些策略融合了CRISPR基因编辑、纳米颗粒介导的递送系统、激发子技术和代谢流调控的潜力，以增强植物中次生代谢物的生产。近期进展已实现靶向通路重定向，在模式和药用物种中使青蒿素、紫杉醇和白藜芦醇等化合物产量实现数倍增长。纳米颗粒介导的激发和CRISPR组分的纳米递送进一步增强了代谢流和精确的遗传改变，从而促进代谢物的生物合成。
植物生物活性物质与次生代谢物的作用
植物生物活性物质是存在于植物和多种食物中的一组生化化合物，可促进健康。这些化合物包括生物碱、类黄酮、精油、苷类、单宁和树脂，具有强大的杀菌、抗真菌和抗病毒特性。为了生存于胁迫条件，植物在转录组和代谢组水平发生变化，通过信号通路感知环境和生物信号。它们配备受体和传感器，可识别威胁信号，从而启动对不同胁迫的防御反应。植物产生初级代谢物（对增殖和发育至关重要的化学组分）和生物活性化合物（次生代谢物，是植物在不利条件下生存所必需）。如图所示，在非生物胁迫下，植物细胞产生钙离子和活性氧(ROS)，信号传导至细胞核，激活MAPK通路，导致形成作为植物生物活性化合物前体的次生代谢物。
尽管有益，但这些化合物即使在复杂技术下也因植物体内产量不足而难以提取。因此，现代方法如利用纳米技术的代谢通路工程，通过激发、代谢工程和基因递送等方式支持生物合成。纳米颗粒与毛状根培养的协同作用以及光照条件的微调进一步促进了生产。
纳米颗粒介导的植物激发作用
纳米材料可改变与细胞分裂、运输、组织以及非生物和生物胁迫通路相关的基因表达。这些纳米颗粒被植物吸收后，会发生氧化激增，导致钙离子(Ca2+)和活性氧(ROS)过量。这会激活抗氧化防御系统和MAPK级联反应等，从而通过产生包括植物生物活性化合物在内的酶促和非酶促抗氧化剂来对抗胁迫条件，实现对次生代谢的转录重编程。诱导生理变化并激活植物防御系统以提高植物生物活性化合物产量的过程称为激发作用。如图所示，纳米材料通过产生过量ROS诱导氧化应激，触发抗氧化防御机制，导致脂质过氧化、膜损伤、钙离子激增，激活MAPK信号通路，并改变植物次生代谢。
可引发各种植物反应（如内部防御机制和不同植物生物活性物质的合成）的纳米材料称为激发子。纳米颗粒介导的激发已成为调节次生代谢物积累的多功能非生物策略，但其结果高度依赖于具体情境。响应因植物物种、培养类型、纳米颗粒物理化学性质、剂量、暴露持续时间和培养条件而异。例如，在黑暗条件下培养的红花细胞悬浮培养物中，负载茉莉酸的Fe3O4纳米颗粒在优化浓度20 mg/L下，可诱导绿原酸增加2.26倍。然而，剂量≥40 mg/L会引发铁离子溶解、ROS过度积累以及生物量和代谢物产量下降。
利用纳米技术进行代谢通路修饰
催化剂是能提高反应速率而不改变其标准吉布斯自由能变的化合物，此过程称为催化。大多数生物反应依赖于决定反应特异性的酶（即蛋白质催化剂），使用酶作为催化剂的过程称为酶催化。纳米颗粒可通过提高稳定性、催化效率和动力学性能来增强不同酶的酶活性，超越传统的固定化方法，并可优化酶相互作用，从而实现更高的反应速率和结构化的界面环境。
纳米酶是源自纳米生物材料的合成酶，尺寸范围为1至100纳米，它们与金属配合物、核酸、葡萄糖和其他生物分子等实体具有相似的结构和功能。它们分为两类：(i) 已转化为纳米材料的酶，称为杂化纳米材料酶；(ii) 模拟酶特性同时降低生物催化活性的纳米材料。这些人工酶表现出多酶活性，包括超氧化物歧化酶样功能、过氧化氢酶、过氧化物酶、氧化酶，并通过模拟天然酶功能同时提供卓越的稳定性、催化效率和适应性来增强次生代谢物的生产。如图所示，纳米酶通过影响关键生化途径并作为这些途径的前体来调节植物次生代谢。
例如，过氧化物酶样纳米酶分解过氧化氢(H2O2)，产生活性氧，从而促进次生代谢物的生物合成。相比之下，过氧化氢酶样纳米酶可减轻活性氧以维持稳定的代谢过程。氧化酶样纳米酶通过激活分子氧提高生物传感能力，而超氧化物歧化酶样纳米酶则管理氧化应激，从而优化类黄酮、萜类和生物碱的生产生物合成路线。
用于代谢调节的纳米基因递送
成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)系统是一种可通过RNA编程进行基因编辑的科学工具。CRISPR/Cas基于其与DNA相互作用并在特定位点切割DNA的原理。sgRNA-Cas复合物附着在目标DNA序列上，切割DNA，并在sgRNA结合位置附近识别一个原间隔序列邻近基序(PAM)位点。大多数时候使用病毒载体将这些基因转移到宿主细胞，但病毒载体可能由于与宿主基因组重组或病理插入突变而导致炎症反应和其他不良反应。因此，非病毒递送平台，特别是脂质纳米颗粒(LNP)，因其能够促进高效基因递送而受到广泛关注，这得益于其广泛的稳定性、增加的循环时间、降低的毒性和更低的免疫原性。如图所示，含有Cas9基因的脂质体进入细胞并将Cas9基因递送至细胞核，在期望位点切割DNA并改变一小部分核苷酸序列，从而改变特定蛋白质的合成，这些蛋白质信号传导至不同细胞器，启动不同的代谢途径以生产植物生物活性物质。
CRISPR/Cas9基因编辑系统可以使用Cas9和gRNA的质粒DNA形式引入。当通过脂质纳米颗粒递送pDNA进行基因编辑时，必须考虑几个重要因素。由于质粒需要在细胞核内转录，pDNA的脂质纳米颗粒配方应能实现核进入。这在细胞核膜在有丝分裂期间被破坏的活跃分裂细胞中是可能的。然而，超过10,000个碱基对的CRISPR质粒的大尺寸会降低封装效率。因此，封装不完全的pDNA的负电荷可能会干扰带负电荷的细胞膜，这需要通过将pDNA封装在脂质纳米颗粒纳米材料中来解决。脂质纳米颗粒/脂质复合物系统，已在哺乳动物细胞中广泛验证用于CRISPR货物递送，也适用于植物应用，尽管存在由细胞壁施加的植物特异性限制。跨完整细胞壁的高效递送仍然具有挑战性。然而，阳离子脂质配方已在可再生组织和有限程度上在有壁外植体中证明了其实用性。
纳米颗粒与毛状根培养的整合
当发根农杆菌感染植物根部的特定部位时，受感染的根区会发育出细小的毛状根，其遵循与母根相同的光化学模式，但具有更高的生长速率和光化学活性。植物中的毛状根是由位于发根农杆菌的根诱导(Ri)转移DNA质粒中的根轨迹基因(rol基因)触发的，该基因整合到植物基因组中。毛状根以其遗传稳定性、快速生长、高代谢物产量以及在无激素培养基中无限增殖的能力而闻名。由于毛状根的高稳定性以及无污染物和病原体，毛状根被用于在实验室环境中合成各种植物代谢物。如图所示，该图展示了使用发根农杆菌诱导毛状根以及随后再生改良植株的过程。
例如，睡茄内酯是一种天然存在的类固醇，存在于多种茄科植物的根中，这促使建立根培养以稳定供应该化合物。植物组织培养技术能够在紧凑空间内快速产生大量再生植物或组织，同时保持高克隆稳定性，使其成为生产次生代谢物的有价值的生物技术方法。但与传统的毛状根相比，植物生物活性化合物的产量可以通过激发、发根农杆菌介导的转化和代谢工程来增加。激发子发出的信号被植物细胞膜中的受体检测到，然后启动防御机制，导致次生代谢物的产量和积累增强，这也可以通过过表达某些基因来提高生产力并降低基于植物生物活性物质的药物的制造成本。
挑战与未来展望
CRISPR技术因可能存在意外的基因组编辑而遇到障碍，尽管野生型Cas9和Cas12a已在植物中表现出高特异性。其广泛应用因其高成本以及缺乏药用植物的全面全基因组序列而受到限制。此外，需要更深入地了解DNA修复机制才能获得更精确的编辑结果。类似地，毛状根系统面临生物合成途径严格控制带来的挑战，导致不可预测的基因表达变化。存在多个限速步骤以及同时插入多个基因的挑战进一步阻碍了可扩展性和可靠性。尽管纳米酶显示出前景，但与天然酶相比，其底物特异性较低，并且只能模拟有限范围的催化反应。然而，具有精确电子和几何特征的纳米酶可提供快速的动力学和高效率。未来的研究需要解决纳米颗粒的潜在植物毒性、批次间的可变性、监管框架的缺乏以及从实验室规模到工业生物反应器的扩展挑战。将CRISPR与纳米技术、代谢工程和优化培养条件相结合，为可持续、高效和环境友好地生产高价值的植物源生物活性物质铺平了道路。
