通过浊度和时间分辨小角X射线散射技术监测岩藻多糖（Fucoidan）与β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin）之间的相互作用及复合物形成过程

时间：2026年4月1日

来源：Food Hydrocolloids

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pH梯度下降同步监测褐藻硫酸多糖与β-乳球蛋白动态复合机制，发现分子量、硫酸含量及主链结构差异导致Ffs（2.58×10⁵ Da，27.7%硫酸）快速形成不均质大复合体，而Fsm（6.3×10⁴ Da，17.4%硫酸）需临界pH触发纳米级结合向宏观聚集转变。结合FT-IR、SAXS、DLS及显微分析证实多糖主链构型是调控复合动力学的关键因素。

作者：Thuy Thi Thu Thanh、Aoi Tsujino、Anh Ngoc Nguyen、Luong Dang Vu、Hang Thi Thuy Cao、Yuki Matsumoto、Shinichi Kitamura、Yoshiaki Yuguchi

越南科学技术研究院化学研究所，越南河内Nghia Do区Hoang Quoc Viet路18号

摘要

本文首次采用了一种新的方法，结合浊度和时间分辨小角X射线散射（Time-Resolved Small Angle X-ray Scattering, SAXS）技术以及D-葡萄糖酮-δ-内酯（D-glucono-δ-lactone, GDL）诱导的逐渐降低的pH值，连续监测了聚电解质与蛋白质之间的动态结合过程。研究使用了来自两种褐藻Sargassum mcclurei（Fsm）和Fucus serratus（Ffs）的两种岩藻多糖。这两种岩藻多糖的骨架分别由（1→3）-和（1→4）-连接的残基以及（1→3）-连接的α-L-岩藻吡喃糖残基组成，它们与β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin, β-Lg）形成了复合物。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析表明，岩藻多糖与β-Lg之间的复合物形成主要由静电相互作用驱动，并得到氢键的辅助。两种技术的成功应用表明，随着pH值的下降，复合物的形成过程从分子/纳米尺度上的结合（通过小角X射线散射观察到）发展为宏观尺度上的聚集（通过浊度观察到）。进一步通过动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对岩藻多糖-蛋白质复合物的微观结构进行了表征。结果发现，β-乳球蛋白-岩藻多糖复合物的形成强烈依赖于岩藻多糖的结构：Ffs具有较高的分子量（Mw）、较高的硫酸盐含量和较简单的结构，因此较早且逐渐形成了一个大的、不均匀的复合物网络；而Fsm由于分子量较低、硫酸盐含量较低且具有交替的骨架结构，在pH值下降过程中从小的复合物状态迅速转变为大的聚集体。利用Debye-Bueche函数进行的定量分析显示，Ffs的不均匀长度（a）从结合初期就开始增加，而Fsm在达到临界pH值之前没有不均匀性。这些结果证实了多糖的结构和分子量对pH依赖性聚集过程具有决定性影响。

引言

岩藻多糖是一种硫酸化的多糖，从褐藻的细胞壁中提取而来。其骨架由硫酸化的岩藻聚糖组成，主要类型有两种：一种是由（1→3）-连接的α-L-岩藻吡喃糖残基构成，另一种是由（1→3）-和（1→4）-连接的残基交替排列构成，同时还含有半乳糖、甘露糖和葡萄糖等其他单糖（Chevolot等人，1999年；Thanh等人，2013年；Yuguchi等人，2016年）。这种独特的组成赋予了岩藻多糖多种生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗凝血、抗HIV作用，以及调节胆固醇和血脂水平的功能（Jin等人，2013年；Trinchero等人，2009年；Cumashi等人，2007年；Thanh等人，2015年；Uraipan等人，2021年；Huang等人，2019年）。岩藻多糖的生物活性机制非常复杂，通常取决于其特定的化学结构（如分子量、硫酸化程度和主链结构）（Zhou等人，2024年；Hamouda等人，2025年；Ale等人，2011年）。在生物化学和材料科学领域，硫酸化多糖与蛋白质形成的复合物在决定它们的生物功能方面起着重要作用。这种复合物的形成对于食品应用（如共凝聚、凝胶）和先进材料（如药物输送、组织再生）至关重要（Wang等人，2007年；Schmitt & Turgeon，2011年；Bealer等人，2020年）。此外，研究岩藻多糖与已知蛋白质的相互作用和复合作用也是理解其生物活性的新途径（Cooper等人，2005年；Zayed等人，2023年；Tissot等人，2023年；Maksimenko等人，2023年）。 β-乳球蛋白（β-Lg）是这项研究的理想模型，因为它具有全局重要性和pH依赖性的电荷特性。在低于其等电点（pI = 5.2）的酸性环境中，β-Lg表现为阳离子聚合物，这一特性有助于研究其与阴离子多糖的复合作用（Creamer等人，2011年）。在聚电解质-蛋白质复合物的研究中，一个主要限制是传统方法通常只分析最终沉淀物，而忽略了pH变化过程中的动态组装过程。Burova等人（Burova等人，2022年）报道了β-Lg-岩藻多糖复合物的形成和稳定性。其他研究者也采用了pH诱导技术来研究蛋白质-多糖的动态变化（Mekhloufi等人，2005年）。岩藻多糖骨架结构与其组装动力学之间的关系仍不清楚，特别是为什么具有交替骨架的岩藻多糖与具有简单重复骨架的岩藻多糖的行为会有所不同。本研究旨在阐明这一机制。在这项工作中，将浊度和时间分辨小角X射线散射（SAXS）技术与D-葡萄糖酮-δ-内酯（GDL）结合使用，以监测岩藻多糖与β-乳球蛋白的相互作用和复合作用。浊度用于监测宏观聚集体的形成，而时间分辨SAXS用于监测纳米尺度上的结合结构。此外，利用Debye-Bueche散射函数可以对复合物的大小和不均匀性进行定量分析，从而提供比简单视觉观察更深入的科学依据。本研究介绍了一种实时观察蛋白质-多糖复合物形成的新方法。通过使用GDL驱动的酸化过程（而非可能导致混合不均匀的手动酸滴定），pH值被均匀且平滑地降低。将这种均匀的酸化过程与时间分辨SAXS结合使用，本研究能够连续绘制出不均匀长度（a）和散射强度（I(0)）的变化图谱。最后，通过DLS、SEM和TEM直接表征了岩藻多糖-蛋白质的微观结构。这种方法首次直接观察到了在宏观浊度出现之前的纳米结构“成核”阶段，从而更好地理解了多糖骨架结构如何决定蛋白质复合物的形成过程。为了建立明确的结构-功能关系，本研究特别关注了来自Sargassum mcclurei和Fucus serratus的两种具有不同骨架结构、硫酸盐含量和分子量的岩藻多糖。骨架结构通过核磁共振（NMR）进行了确认，而傅里叶变换红外光谱（FT-IR）用于分析结构特征并确认复合物的形成。

材料

来自Sargassum mcclurei（Fsm）的岩藻多糖是从越南Nha-Trang湾采集的褐藻中提取的，提取方法参考了我们之前的论文（Yuguchi等人，2016年）。

来自Fucus serratus（Ffs）的岩藻多糖购自BIOSYNTH公司（代码YF09360；CAS 9072-19-9），未经进一步纯化即可使用。

β-乳球蛋白（分子量：18400 Da，等电点：5.2）购自Sigma-Aldrich公司。

岩藻多糖-β-Lg复合物的制备

将β-Lg（浓度为0.1%至1.5%wt）与岩藻多糖混合

结果与讨论

通过多角度激光光散射检测（SEC-MALS）测得Fsm和Ffs的重量平均分子量（Mw）分别为6.3 x 10⁴和2.58 x 10⁵。通过明胶/BaCl₂方法（Dodgson，1961年）测得Fsm和Ffs的硫酸盐含量分别为17.4±2.70%和27.7 ± 3.35%w。

从Sargassum mcclurei中提取的岩藻多糖的¹H-NMR光谱（图2a）显示信号复杂且重叠。

结论

本研究利用浊度和时间分辨小角X射线散射（SAXS）的同步监测平台，成功表征了β-乳球蛋白与两种结构不同的岩藻多糖（Fsm和Ffs）之间的动态结合过程。通过使用GDL诱导的逐渐酸化过程，可以连续观察复合物的形成。研究结果表明，多糖骨架的初级结构对复合物的动力学和内部形态起着决定性作用。

作者贡献声明

Luong Dang Vu：实验研究、数据分析。 Hang Thi Thuy Cao：资源准备、实验研究。 Yuki Matsumoto：实验研究、数据分析。 Shinichi Kitamura：实验研究、数据分析。 Yoshiaki Yuguchi：初稿撰写、项目管理、资金筹集、数据分析、概念构思。 Thuy Thi Thu Thanh：初稿撰写、审稿与编辑、资源准备、实验研究、资金筹集、数据分析。 Aoi Tsujino：初稿撰写。