在生命活动的复杂舞台上，蛋白质的合成与降解是维持细胞稳态的核心环节。其中，泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）作为真核细胞内最主要的蛋白质质量控制途径，负责精准降解错误折叠、受损或不再需要的蛋白质。这个系统的“粉碎机”核心——26S蛋白酶体（26S proteasome），是一个由20S核心颗粒（20S core particle, CP）和19S调节颗粒（19S regulatory particle, RP）组成的、分子量高达250万道尔顿的巨型分子机器。19S RP中的六个ATP酶亚基（RPT1-RPT6）构成了一个环状的马达（ATPase motor），它们利用水解ATP（adenosine triphosphate）释放的化学能，像一台精密的“分子绞肉机”一样，将泛素标记的底物蛋白展开、去折叠，并拖入20S CP的腔室中进行降解。这一过程对细胞周期调控、基因表达、免疫应答乃至神经退行性疾病和癌症的发生都至关重要。
然而，尽管科学家们通过冷冻电镜（cryo-EM）等技术捕捉到了这个庞然大物的许多“定格快照”，一个根本性问题依然悬而未决：这个环状的ATP酶马达，究竟是如何将ATP水解的化学能，一步步、精准地转化为拉动和展开蛋白质的机械力的？ 传统的“手递手”（hand-over-hand）模型认为，ATP的水解在ATP酶环上顺序发生，驱动着亚基构象的协同变化，从而像爬楼梯一样将底物蛋白“拽”进去。但这个模型更多是基于静态结构的推测，缺乏对动态过程中能量如何传递、构象如何按顺序转变的定量描述。大多数高分辨结构只能捕捉特定条件下的少数构象，无法揭示沿化学反应途径的时间顺序事件。因此，AAA+ ATPase马达进行底物易位（substrate translocation）的确切机制，特别是其非平衡化学机械转导（nonequilibrium chemomechanical transduction）的动力学细节，仍然不甚清晰。
为了揭开这一谜题，研究人员在《npj Biological Physics and Mechanics》上发表了一项研究，他们开发了一个非平衡概率模型 ，旨在模拟26S蛋白酶体ATP酶马达在底物展开和易位过程中的化学机械转导循环。这项研究的核心目标是，在理论上刻画ATP酶马达的动态过程，通过假设马达在可行构象间的随机跃迁，来模拟化学能与机械功转换的微观步骤。他们的模型预测与广泛的已发表实验观察结果一致，并在一系列新的实验中得到验证，为我们理解这个精密分子机器的运作原理提供了前所未有的定量视角。
为了开展这项研究，作者们主要运用了计算模拟与模型构建 这一关键技术方法。他们基于先前高分辨率冷冻电镜观测到的结构信息，建立了一个最小化的随机动力学模型。该模型将ATP酶马达的构象归纳为31种（H1-H31，其中H1-H30包含不同数量的底物脱离亚基，H31为六个亚基全部结合底物的非易位构象），并模拟了核苷酸结合口袋中ATP的随机结合、水解以及马达构象之间的马尔可夫跃迁过程。模型参数部分源自已发表的实验测量数据，部分通过拟合实验观测的易位速率曲线确定。随后，他们使用Gillespie随机模拟算法 对超过50万随机步骤进行计算，以获取平均易位速率、构象跃迁概率等统计信息，从而在理论上探索比实验观测更广泛的协同构象转变范围。
结果部分揭示了ATP酶马达工作的精细图景：
1. 建立非平衡概率模型
研究人员基于早期实验结构观察，构建了一个包含31种可行构象的随机模型。该模型遵循“手递手”原则，即只有最靠近核心颗粒的RPT亚基可以从底物上脱离，并移动到“楼梯”顶部重新结合底物。ATP水解仅在相邻亚基间的闭合界面（closed interface）发生，其化学能被转化为驱动构象变化的机械能，打破了马达微观状态的详细平衡，输出推动底物易位的机械功。模型还引入了高ATP浓度下可能出现的非易位构象H31，解释了实验中观察到的ATP抑制效应。
2. 底物在ATP酶马达中的易位动力学
通过模拟，研究人员发现底物易位速率随ATP浓度变化并非单调递增。在ATP浓度低于1 mM时，易位速率随浓度增加而上升，此时ATP结合是限速步骤。但当ATP浓度超过1 mM后，易位速率达到峰值后下降，表明在饱和条件下，限速步骤转变为ATP水解、ADP释放及相关构象变化。这一现象与近期实验发现的高ATP浓度抑制效应一致。同时，模拟显示ADP和ATP类似物ATPγS（不易被水解）的竞争性结合会降低易位速率，其抑制曲线与实验数据高度吻合。
3. 化学机械耦合的多样性
通过分析不同ATP浓度下31种构象间的跃迁概率，研究发现马达存在多种构象转变途径。在生理性低ATP浓度下，马达呈现多样化的构象变化，但易位较慢。在高ATP浓度下，最可能的构象跃迁集中在24种关键变化上。对这些主要跃迁的分析表明，它们可归纳为四种主要的运行模式 。这些模式共同的特点是：靠近核心颗粒底部的一个或两个RPT亚基因ATP水解而从底物上脱离，而之前脱离的亚基则在顶部结合ATP后重新抓住底物，导致底物向CP方向前进一或两步。其中，一步易位在ATP供应充足时更可能发生，而两步易位在ATP耗竭时频率增加。
4. 紧密折叠底物的展开
当蛋白酶体遇到具有紧密折叠结构域（如用叶酸（folic acid, FA）稳定的二氢叶酸还原酶（DHFR）结构域）的底物时，马达需要克服更高的能量屏障。模拟显示，随着FA的加入（相当于增大了马达需要克服的底物阻力Fsub ），底物降解速率显著下降。模拟结果与实验测得的降解速率变化趋势一致，且归一化后的速率曲线重叠，表明模型能有效复现马达在遇到折叠阻力时的行为。
5. 能量转导效率
研究人员进一步计算了AAA-ATPase复合体在构象变化周期中的能量变化。模拟显示，ATP水解会提高马达的总能量，随后在推动底物前进的构象变化过程中，能量降低，机械功得以输出。通过改变底物阻力Fsub ，他们评估了马达的能量转换效率。效率在低阻力时较低，随着阻力增加达到峰值，然后在阻力过高导致马达近乎停转时下降。同时，模拟预测，随着阻力增加，马达中结合的ADP分子数量会增多，这一预测与最新的冷冻电镜结构观察结果一致：在易位受阻的蛋白酶体结构中，确实观察到了更多（3-5个）结合状态的ADP。
结论与讨论 部分强调了本研究的理论贡献和广泛意义。这项工作建立的随机模型，以定量方式阐述了“手递手”机制，模拟了ATP、ADP、ATPγS浓度以及叶酸等因素对易位速率的影响，其预测得到了两项伴随实验研究的支持。模型识别出的四种主要化学机械转导模式，与实验中观察到的众多中间构象态相吻合，特别是预测了“两个连续的ATP酶同时从底物上脱离”的中间构象，这为理解易位起始步骤提供了新见解。
研究指出，由于蛋白水解性AAA+ ATPase通常具有保守的六聚体环状结构，因此本模型所模拟的力产生和底物易位的化学机械耦合机制，很可能在整个AAA+蛋白酶超家族中是保守的。不同物种（人、酵母）的蛋白酶体以及大肠杆菌的ClpX在ATPγS抑制曲线上的行为一致性，也支持了这一观点。尽管存在步长和速率等细节差异，但核心的“手递手”能量转导逻辑可能是共通的。
总之，这项研究通过计算建模，弥补了实验手段在捕捉快速动态过程方面的不足，为理解26S蛋白酶体这一复杂分子机器的非平衡功能动力学建立了一个定量框架。它不仅深入揭示了蛋白酶体自身的工作机制，其理论框架也有望推广至整个AAA+蛋白酶超家族，对于从物理力学角度理解细胞内蛋白质稳态调控这一基本生命过程具有重要意义。
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