马里乌什·拉德基维奇（Mariusz Radkiewicz）|阿格涅什卡·布齐科夫斯卡-尤拉（Agnieszka Bzikowska-Jura）|A. 莫拉斯（A. Molas）|E. 贝尔蒂诺（E. Bertino）|S. 甘迪诺（S. Gandino）|C.H. 范德阿克尔（C.H. Van Der Akker）|I. 德拉兹科夫斯卡（I. Drazkowska）|P. 加维尔（P. Gawel）|M. 加沃龙斯卡（M. Gawronska）|约翰内斯·B·范古多弗（Johannes B. van Goudoever）|B. 克罗拉克-奥莱尼克（B. Królak-Olejnik）|E. 辛基维奇-达罗尔（E. Sinkiewicz-Darol）|S. 索特马诺（S. Sottemano）|P. 托内托（P. Tonetto）|A. 韦索洛夫斯卡（A Wesolowska）
**波兰科学院生物化学与生物物理学研究所质谱实验室**
**摘要**
当母乳不可用时，捐赠的人乳（DHM）是早产儿的首选替代品，尽管其营养成分会随着哺乳阶段的不同而变化。本研究评估了人乳中维生素浓度随时间的变化情况。共收集了189份原始母乳样本，这些样本来自72位捐赠者，在产后三个不同时间点采集：2-12周、13-16周和17-24周。使用LC-MS方法测定了包括B族维生素、维生素C和维生素D在内的13种维生素的浓度。发现几种B族维生素存在显著的时间依赖性变化：硫胺素从2-12周的29.5 ng/mL增加到17-24周的45.2 ng/mL（p=3.5E-09），而硫胺素单磷酸盐从404 ng/mL下降到240 ng/mL（p=5E-04）；吡哆醛水平从77.3 ng/mL上升至97.8 ng/mL（p=3.4E-02）。相比之下，维生素C（22.6 µg/mL）和维生素D（0.9 ng/mL）在整个哺乳期间保持稳定。这些结果表明人乳中的维生素成分存在可测量的变化，尤其是与硫胺素相关的化合物和某些B族维生素，而维生素C和维生素D则显示出时间上的稳定性。建议持续监测人乳的营养成分，因为这些变化可能会影响其满足早产儿营养需求的能力。未来的研究应探讨这些发现的临床意义。
**1. 引言**
人乳在婴儿出生后的前6-12个月中起着至关重要的作用，提供了健康发育所需的关键宏观和微量营养素。人乳有助于婴儿的最佳生长，并与降低日后代谢紊乱（如肥胖和2型糖尿病）的风险相关（Borer, 2025）。世界卫生组织（WHO）建议纯母乳喂养或主要母乳喂养至6个月大，并鼓励继续母乳喂养至2岁，同时添加其他食物；而欧洲儿科胃肠病学、肝病学和营养学会（ESPGHAN）则建议纯母乳喂养至4个月大，主要母乳喂养至6个月大。如果早产儿的母亲无法提供母乳，建议使用捐赠的人乳（DHM）（Tyebally Fang et al., 2021; WHO关于母婴护理的建议, 2022; 欧洲儿科胃肠病学、肝病学和营养学会, 2024）。尽管人们对人乳中的宏量营养素组成给予了较多关注，但关于维生素组成的系统分析仍相对较少，且缺乏标准化的分析方法（Gates et al., 2023, Bala, 2024, Fu et al., 2024）。现有的研究往往仅针对个别维生素，而这些维生素的缺乏可能是由于捐赠者的饮食等因素造成的（Castro et al., 2021, Greco et al., 2025）。
维生素是必需的微量营养素。除维生素D和烟酸（B3）外，大多数维生素不能在人体内合成，因此必须通过饮食获取。B族维生素包括硫胺素（B1）、核黄素（B2）、烟酸（B3）、泛酸（B5）、吡哆醇（B6）、生物素（B7）、叶酸（B9）和钴胺素（B12）及其各自的活性形式（Gregory et al., 2005）。B族维生素对能量代谢（B1, B2, B6, B7）、氨基酸合成（B1, B6, B7, B9）、DNA合成与修复（B3, B12）以及神经生理功能（B1, B6, B9）至关重要（Dror and Allen, 2018, Gibney, 2009, Hanna et al., 2022）。硫胺素缺乏在亚洲国家较为普遍（Smith et al., 2021），儿童缺乏硫胺素会导致干性脚气，表现为肢体麻木和运动障碍（Gomes et al., 2021）；神经病变导致语言延迟和运动系统功能障碍（Fattal-Valevski et al., 2009）；以及肺动脉高压和心脏功能受损（Andersen et al., 2013）。B2缺乏与皮肤和神经系统疾病有关（Dror & Allen, 2018）。烟酸是色氨酸代谢的产物，存在两种生物活性形式——尼克酸和烟酰胺，两者都对细胞代谢至关重要（Gibney, 2009）。B5是一种关键的辅酶和 cofactor，参与约4%的哺乳动物酶的功能，在能量代谢中起重要作用（Kennedy, 2016）。B5在大脑中的浓度是血浆中的50倍，有助于胆固醇、磷脂和脂肪酸的合成，以及神经递质（特别是乙酰胆碱）的生成，被认为在髓鞘形成过程中起关键作用（Ismail et al., 2020, Uchida et al., 2015）。
维生素C是单加氧酶和双加氧酶的重要辅因子，具有抗氧化作用，通过维持胶原蛋白的羟基化来支持其稳定性（Peterkofsky, 1991）。维生素C以其免疫调节作用而闻名，能增强白细胞活性、抗体产生和干扰素合成（Dror & Allen, 2018）。维生素C缺乏会导致坏血病，表现为胶原蛋白合成受阻、血管脆弱和组织损伤。维生素D在钙和磷酸盐的稳态中起关键作用，对骨骼矿化和骨骼发育至关重要。其生物活性形式1,25-二羟基维生素D（1,25(OH)₂D₃）调节肠道对钙和磷酸盐的吸收，促进骨骼钙化（Bouillon et al., 2003），从而促进纵向生长和牙釉质形成（Simmer & Fincham, 1995）。此外，维生素D还具有重要的免疫调节功能，包括调节炎症反应和刺激抗菌肽的产生（Mora et al., 2008）。婴儿期维生素D缺乏可能导致佝偻病，表现为骨骼矿化障碍、骨骼畸形和生长异常（Holic, 2007）。
尽管人乳中的维生素已研究了几十年，但大多数现有报告仅关注个别维生素或小范围的维生素组合，经常采用异质的分析方法和横断面采样设计。对不同哺乳阶段的人乳进行全面的、标准化的多维生素分析仍十分有限。这一差距在母乳库背景下尤为突出，因为了解微量营养素组成的时间变化对于营养评估和临床应用至关重要。因此，本研究旨在使用经过验证的串联质谱（LC-MS/MS）平台，对人乳中的13种维生素进行纵向、多维生素评估，以实现跨哺乳期的维生素动态综合分析。基于这些考虑，我们采用定制的液相色谱与LC-MS/MS定量方法，研究了人乳中13种维生素的含量及其时间变化。
**2. 材料与方法**
**2.1. 研究设计和人乳样本收集**
本研究包括来自波兰、意大利和荷兰的三组人乳捐赠者，分别在2020年2月至2022年5月期间从六个母乳库（波兰四个、意大利一个、荷兰一个）招募。纳入标准包括符合欧洲母乳库协会指南的捐赠者资格，并提供书面知情同意书。所有参与国家的当地伦理委员会均批准了本研究（波兰华沙医科大学生物伦理委员会批准决定号AKBE/39/2020；意大利人群批准决定号2021.0597；荷兰人群批准决定号169849）。人乳样本在产后三个时间点采集：2-12周（A）、13-16周（B）和17-24周（C）。共收集了72位母亲的189份样本：A点72份、B点63份、C点54份。各国招募时间线因后勤因素（包括伦理批准、人员变动或地点变更，尤其是COVID-19大流行造成的中断）而有所不同，这些因素可能影响了招募结果。招募过程和样本数量详见图1。
**2.2. 人乳收集和一般处理**
人乳样本在上午8:00至10:00之间采集。捐赠者被要求挤出5-10毫升的前乳和后乳（总共10-20毫升）。每次采集的前乳和后乳充分混合后制成均质混合物，再冷冻备用分析，以减少样本间的营养成分差异。样本随后在-20°C下冷冻，直至进一步分析。
**2.3. B族维生素的LC-MS定量**
使用11种B族维生素及其同位素标记类似物的标准品制备了储备溶液（1 mg/mL，详细信息见补充材料）。分析时，将50 µL预处理过的人乳转移到1.5 mL样品管中，与250 µL含有0.1%甲酸的内标溶液（硫胺素-13C3、核黄素-13C415N2、烟酸-13C6、烟酰胺-13C6、泛酸-13C315N、生物素-d4、叶酸-d4、吡哆醛-d3、吡哆醇-d3，浓度均为2 ng/mL）混合。样品以1500 RPM转速涡旋10分钟后，以14000 RPM转速离心10分钟。然后转移至新的样品管中，在50°C的水浴中用氮气流吹干至干燥。样品重新溶解于200 µL含0.2% NH4OH的20 mM甲酸盐溶液中，并涡旋10分钟。通过加入400 µL己烷提取脂质，以1500 RPM转速涡旋10分钟后以14000 RPM离心10分钟，丢弃己烷层，将水相转移到色谱用的聚丙烯小瓶中。
**2.4. 维生素C的LC-MS定量**
分析时，将25 µL预处理过的人乳放入新的1.5 mL样品管中，加入100 µL 10 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）和100 µL含有维生素C（浓度为5 µg/mL）的3%偏磷酸溶液，混合1分钟。样品在室温下孵育30分钟，然后离心并转移到色谱用的聚丙烯小瓶中。
**2.5. LC-MS定量其他维生素**
**2.5. 维生素D的LC-MS定量**
**2.6. 固相萃取（SPE）**
使用Oasis HLB SPE板（30 µm，10 mg吸附剂）进行固相萃取。先用500 µL 0.1%甲酸处理板，再加入500 µL MeOH，最后加入500 µL含0.25% NH4OH的溶液。向板中加入500 µL样品和校准品，并向每个通道加入500 µL含0.25% NH4OH的IS溶液（维生素D-13C6，浓度为5 µg/mL）。板在500 RPM转速下涡旋10秒，随后使用正向压力处理器（Waters）进行洗脱。加样的板依次用500微升5%甲醇和500微升60%甲醇清洗。新鲜的4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮（PTAD，1毫克/毫升）在ACN和乙醇胺（EA）的1:1混合物中制备，用作衍生化和洗脱溶液。样品用75微升衍生化溶液从SPE中洗脱，并收集在96孔板上。溶液在室温下放置一小时进行衍生化。色谱分离使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统进行，分析柱为ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl（1.7微米，2.1毫米×100毫米）（Waters），温度为70°C。流动相A由Mili-Q级水中的0.1%甲酸组成，流动相B由LC-MS级甲醇中的0.1%甲酸组成。总运行时间为4分钟。质谱在ESI+模式下运行，调整参数为：毛细管电压2.5千伏，锥体电压50.0伏，脱溶剂温度600摄氏度，脱溶剂气体流量1000升/小时，锥体气体流量250升/小时。
2.6 方法开发和验证
通过直接将纯分析物溶液注入质谱仪，并在逐步增加的碰撞能量下选择最佳质量转移，以实现子离子的最大丰度，来进行多反应监测（MRM）模式的开发。每个分析物都选择了其最适宜的锥体能量，以检测到母离子的最高信号。为了评估校准曲线的线性，根据分析物类别的生物利用率，在不同范围内准备了三条校准曲线，并使用加权线性回归（权重因子1/x）进行测试。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别确定为信噪比至少为3和10的分析物浓度。重复性和再现性（精度）通过在同一天由同一分析师在三个不同水平（低、中、高）对五个质量控制（QC）样本进行重复实验，并在另一天由同一分析师进行实验来测定，计算相对标准偏差（RSD）来确定。通过向提取后溶液中添加内标物来测量基质匹配回收率，并通过从总测量浓度中减去基线浓度然后除以内标物浓度值来计算。验证标准在表1中总结。有关方法参数的详细信息在补充材料中提供。
表1. 维生素B、C和D定量验证的总结接受标准。
线性范围
维生素B 1 – 2000 ng/mL
维生素C 0.1 – 100 µg/mL
维生素D 0.1 – 40 ng/mL
线性系数（R²）≥0.950
LOD/N比率至少为3
LOQ/N比率至少为10
精度
低QC <15%
中QC <10%
高QC <5%
回收率 >80%
准确性 90 – 110%
2.7 统计分析
数据分析使用GraphPad Prism版本10.4.2进行。采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA，p=0.05）来检测维生素浓度之间的差异。使用两阶段线性逐步升强的Benjamini、Krieger和Yekutieli程序进行假发现率调整，Q值为5%。随后进行Tukey’s HSD检验（α=0.05），以比较不同乳汁收集时间点（A、B和C）的维生素水平。使用Spearman非参数相关性检验（双尾，95%置信区间）来评估变量之间的关联。使用相同的软件生成气泡图、小提琴图和相关性矩阵图。
3. 结果
表2总结了选定的维生素在三个测量时间点的平均和中位数浓度。泛酸（维生素B5）是含量最丰富的维生素，在所有B族维生素中 DHM 中的平均浓度最高，第2-12周的平均浓度为2143 ng/mL（±802），随后12周内相对稳定，第13-16周的平均浓度为2064 ng/mL（±800），第17-24周为2064 ng/mL（±787）。相比之下，叶酸的浓度最低，A时间点的平均浓度为4.9 ng/mL（±6.4），B时间为4.6 ng/mL，C时间为4.9 ng/mL。维生素B6的衍生物吡哆醇在大多数DHM样本中无法检测到，其平均浓度低于定量限（A时间为0.2 ng/mL，C时间为0.1 ng/mL）。
表2. 捐赠人乳样品中维生素浓度的结果（n=189）。
维生素 A时间（2 - 12周） B时间（13 - 16周） C时间（17 - 24周）
平均值 ± 标准差 中位数（IQR） 平均值 ± 标准差 中位数（IQR）
硫胺素（B1） 29.5 ± 13.8 29.2 (19.1 - 37.2) 40.8 ± 13.2 41.0 (33.4 - 42.7)
硫胺素单磷酸盐（B1） 404 ± 218 413 (241 - 630) 267 ±197 273 (144 - 414)
总B1 440.68 ± 212 450.21 (279.56 – 580.56) 284.03 ± 136.79 292.09 (178.53 – 350.89)
核黄素（B2） 72.8 ± 77.4 48.5 (35.2 - 58.8) 100 ± 107 60.2 (39.1 - 81.8)
烟酸（B3） 8.9 ± 20.2 2.7 (1.6 – 5.0) 20.1 ± 96.3 2.5 (1.0 - 5.8)
烟酰胺（B3） 486 ± 313 407 (296 – 570) 437 ± 235 469 ± 275 414 (282 - 557)
总B3 495 ± 316 410 (302 - 556) 457 ± 233 390 (297 - 621)
泛酸（B5） 2143 ± 802 2016 (1621 - 2585) 2064 ± 800 1853 (1529 - 2421)
吡哆胺（B6） 10.6 ± 9.5 8.7 (0.0 - 14.2) 27.3 ± 72.7 14.7 (9.0 - 22.0)
吡哆醇（B6） 0.2 ± 1.2 0.0 (0.0 - 0.0) 0.7 ± 5.2 0.0 (0.0 - 0.1)
吡哆醛（B6） 77.3 ± 43.1 66.9 (49.6 - 91.3) 102 ± 46.4 95.6 (66.4 - 114)
总B6 87.9 ± 47.3 78.2 (53.1 - 110) 129 ± 88.5 112 (79.7 - 136)
生物素（B7） 7.1 ± 6.2 5.6 (3.8 - 7.6) 25.4 ± 109 5.6 (3.5 - 7.6)
叶酸（B9） 4.9 ± 6.4 2.5 (0.0 - 7.4) 4.6 ± 7.8 0.0 (0.0 - 8.1)
维生素C 22.6 ± 15.2 19.0 (10.9 - 33.8) 25.7 ± 16.1 24.2 (13.2 - 33.8)
25-羟基维生素D3（D） 0.9 ± 0.6 0.8 (0.5 - 1.4) 0.9 ± 0.5 0.8 ± 0.5 0.8 ± 0.5
所有B族维生素和25-羟基维生素D3的浓度以ng/mL表示，而维生素C的浓度以µg/mL表示。烟酸（B3）的总水平计算为烟酸和烟酰胺的总和，而B6的总水平计算为吡哆胺和吡哆醛的总和，不包括吡哆醇。维生素C的浓度相对稳定，A时间的平均值为22.6 µg/mL（±15.2），C时间为25.3 µg/mL（±13.9）。同样，25-羟基维生素D3的水平也非常稳定，A时间的平均值为0.9 ng/mL（±0.6），C时间为0.8 ng/mL（±0.5）。五种B族维生素在测试期间显示出显著变化，这通过单因素方差分析（ANOVA）确定：硫胺素（p=3.49E-9）、硫胺素单磷酸盐（TMP）（p=1.32E-05）、吡哆胺（p=1.26E-02）、吡哆醛（p=4.18E-03）和叶酸（p=2.15E-02）。应用Benjamini、Krieger和Yekutieli方法（Benjamini等人，2006）进行假发现率（FDR）校正后，发现三种维生素（硫胺素（p=3.49E-9）、TMP（p=1.32E-05）和吡哆醛（p=4.18E-03）具有显著性。维生素C（p=4.27E-01；p-adj=5.03E-01）和25-羟基维生素D3（p=8.11E-01；p-adj=7.10E-01）在三个时间点上没有显著变化。ANOVA统计结果和FDR调整的结果总结在表3中。
表3. 在产后2至24周收集的捐赠人乳样品中13种维生素浓度的ANOVA结果。报告了原始p值和FDR调整后的p值。
维生素 p值 p-adj
硫胺素（B1） 3.49E-09 3.66E-08
硫胺素单磷酸盐（B1） 1.32E-05 6.93E-05
核黄素（B2） 1.08E-01 2.27E-01
烟酸（B3） 4.31E-01 5.03E-01
烟酰胺（B3） 5.87E-01 6.16E-01
泛酸（B5） 6.11E-01 7.10E-01
吡哆胺（B6） 1.26E-02 2.14E-01
吡哆醇（B6） 3.35E-01 5.03E-01
吡哆醛（B6） 4.18E-03 1.46E-02
生物素（B7） 6.05E-01 3.08E-01
叶酸（B9） 2.15E-02 7.92E-01
25-羟基维生素D3（D） 8.11E-01 7.10E-01
使用Tukey’s HSD事后检验对三种显著不同的B族维生素进行了多重比较（图2）。硫胺素浓度在2至24周之间增加，A和B时间点之间以及A和C时间点之间存在显著差异（p.adj= 1.57E-05；p.adj=9.18E-09）。相比之下，TMP在同一时期下降，并且在A和B时间点（p.adj=4.95E-04）以及A和C时间点（p.adj=4.90E-05）之间存在显著差异。吡哆醛浓度呈现上升趋势，在A和B时间点（p.adj=5.91E-03）以及A和C时间点（p.adj=3.46E-02）之间存在显著增加。硫胺素和TMP浓度在三个时间点上显示出相反的时间趋势（图3）。
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图2. 小提琴图表示三个时间点A、B和C的硫胺素、硫胺素单磷酸盐和吡哆醛水平。显著性水平用星号表示：*p=0.05，**p=0.01，***p=0.001。
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图3. 硫胺素和硫胺素单磷酸盐浓度（ng/mL）的时间依赖性变化。每个点代表一个单独的样本。
进行了Spearman相关性系数测试以确定变量之间的相关性。相关性热图的图形表示见图4。硫胺素和TMP显示出中度的负相关性（r=-0.62，p<0.0001），表明TMP的减少与DHM中自由硫胺素的相应增加有关。
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图4. 使用Spearman排名的相关性矩阵。红色表示负相关，蓝色表示正相关。颜色越深，相关性越强。硫胺素和硫胺素单磷酸盐呈负相关（r=-0.6），p=2.79E-2。
4. 讨论
在这项研究中，我们分析了哺乳期前六个月内DHM中多种维生素的浓度和时间趋势。我们发现硫胺素浓度随时间增加，同时TMP逐渐减少。硫胺素存在多种形式，包括其磷酸化衍生物，如TMP、硫胺素二磷酸盐（TDP）和硫胺素三磷酸盐（TTP），其中TTP是能量代谢和线粒体功能的关键酶辅因子，特别是在磷酸戊糖途径（PPP）中（Zhao等人，2002）。硫胺素以磷酸化形式从肠道腔吸收，然后被硫胺素焦磷酸酶等酶去磷酸化（Rindi & Laforenza，2000）。我们观察到TMP的逐渐减少伴随着HM中自由硫胺素的同步增加。这一观察结果与Wang等人（2025）的发现一致，他们也报告了哺乳期间硫胺素和TMP之间的负相关。我们的成熟乳中硫胺素浓度高于Wang等人（2025）的报告值，但与Ren等人（2015）的描述一致。HM中TMP的逐渐减少是由于其去磷酸化或水解成自由硫胺素（Hampel等人，2016）。TMP是TTP去磷酸化为自由硫胺素的产物，而不是其合成的底物。有趣的是，TMP的水平在脑脊液（Tallaksen等人，1997）中高于自由硫胺素，而且TMP的细胞摄取由组织特异性载体介导，这会影响细胞的硫胺素状态（Zhao等人，2002）。核黄素（维生素B2）对黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的合成至关重要，这两种物质是细胞能量代谢的关键辅酶。我们的研究显示其浓度相对较高且稳定。Roughead和McCormick（1990）的早期数据显示HM中的核黄素水平较高。然而，作者仅从5名参与者那里收集样本，并使用了比LC-MS方法灵敏度低得多的检测方法，因此他们的报告中的高核黄素水平可能是由于方法不确定性的结果。HM中的核黄素浓度主要与母体的摄入量有关。各地区饮食差异可能解释了不同研究中HM核黄素浓度的差异，例如Sakurai等人（2005）报告的日本母亲中的核黄素水平较低。烟酸（维生素B3）的浓度低于Ren等人（2019）和Redeuil等人（2019）的报告值。Hampel等人（2012）之前描述了HM中烟酸水平的显著变化，他们显示来自不同地理区域的HM样本中的烟酰胺水平存在显著差异（喀麦隆、马拉维、中国和美国）。作者推测这些差异不仅源于地理来源和明显的饮食差异，还与食物强化有关（Hampel等人，2012）。这与Gibson等人（2020）的研究结果一致，他们显示维生素B3的膳食摄入与其在HM中的存在率呈正相关。HM中烟酸水平的差异也源于测量和报告的方法学不一致性。因此，我们的发现强调了标准化HM营养分析方法的必要性（Gibson等人，他们报告称，在哺乳期180天的成熟母乳中，B6的总含量为62.7（40.9，93.9）ng/mL，其中吡哆胺的含量为10.0 ng/mL（6.8，16.0 ng/mL），吡哆醛的含量为92.1 ng/mL（65.0，98.1 ng/mL）。在超过50%的样本中未检测到吡哆醇，因此没有将其计入总B6含量的计算中。这使得哺乳期17至24天的母乳中B6的总含量中位数为36.4 ng/mL（10.4，94.8 ng/mL），使结果更为准确和可靠。维生素B6是母乳中的重要营养素，其水平过低与婴儿行为障碍、哭闹增多以及对刺激反应减弱有关（Rahmanifar等人，1993年）。此外，研究还发现母乳中B6含量高与Brazelton新生儿行为评估量表（NBAS）中的表现提升有显著正相关（Ooylan等人，2002年）。
生物素（维生素B7）在母乳中的含量相对较低。我们的发现与Ren等人（2015年）的研究结果一致，他们报告称过渡期母乳中的生物素平均浓度为2.6 ng/mL，成熟母乳中的生物素浓度分别为9.6 ng/mL（产后31-100天）和6.9 ng/mL（产后101-300天）。我们在产后180天的母乳中观察到生物素浓度保持稳定，其中产后2-12周的中位数为5.6 ng/mL（3.8，7.5 ng/mL），产后13-16周为5.6 ng/mL（3.5，7.6 ng/mL），产后17-24周为5.3 ng/mL（3.0，6.9 ng/mL）。Mock等人（1997年）表明，生物素及其两种类似物——双去氧生物素和生物素亚砜的浓度随时间变化显著。他们证实，哺乳期初期，尤其是从初乳过渡到过渡期母乳的过程中，生物素含量增加而双去氧生物素含量减少最为明显。他们还强调了生物素及其衍生物之间的平衡的重要性，因为之前的研究已经证明双去氧生物素和生物素亚砜会抑制肠道中对游离生物素的吸收（Said等人，1987年）。此外，Gibson等人（2020年）报告称，印尼母亲产后5个月母乳中的生物素中位数为6.4 µg/L。
叶酸（维生素B9）以多种化学形式存在，其中最常见的是5-甲基四氢叶酸。从初乳到哺乳期3个月，母乳中的叶酸含量呈上升趋势，随后在产后6个月趋于稳定并略有下降（Dror & Allen，2018年）。研究发现，叶酸补充仅能提高母乳中游离叶酸的浓度，但并未增加其他叶酸的形式，这种现象对婴儿健康的生物学意义尚不明确（Khambalia等人，2006年；Houghton等人，2009年；West等人，2012年）。有趣的是，叶酸的含量在一天中的不同时间会有所变化，通常随时间推移而升高（Udipi等人，1987年）。Han等人（2009年）的研究显示，叶酸含量与婴儿体重和身长之间没有显著相关性。我们的研究发现，整个哺乳期叶酸含量相对较低且稳定，三个时间段的平均值分别为4.9 ng/mL、4.6 ng/mL和4.9 ng/mL。这可能是因为我们仅测量了叶酸这一从强化食品中获取的补充形式，它很快会被转化为其他形式的叶酸。尽管未代谢的叶酸更容易通过肠道的还原型叶酸转运蛋白（RFC）被吸收（Milman，2012年），但它会立即被肝脏还原酶转化为不同的四氢叶酸形式，尤其是5,10-甲基四氢叶酸，这些形式具有更大的生物学意义（Pertiwi等人，2022年）。Page等人（2017年）研究了母乳中未代谢叶酸（UMFA）和各种叶酸形式的分布。他们发现，每日摄入量超过400 µg的叶酸可能会导致母乳中UMFA含量升高，同时四氢叶酸含量逐渐下降，而后者具有更高的生物活性。他们建议将叶酸的摄入量控制在推荐的每天400 µg以内，因为过高的UMFA含量可能会抑制还原酶的活性，从而减少四氢叶酸的生成。Xue等人（2017年）的研究显示，产后121至240天，母乳中的总叶酸含量从平均7.3 ng/mL增加到23.3 ng/mL。Su等人（2022年）报告称，初乳中的总叶酸浓度为12.9 ng/mL，产后40-45天为54.7 ng/mL，产后200-240天为56.77 ng/mL。他们分别在这些时间点测得的UMFA含量为0.6 ng/mL、0.0 ng/mL和1.2 ng/mL，这与我们的数据一致，证明母乳中的UMFA含量较低。
婴儿每日所需的维生素C量为30-35毫克，平均吸收率为85%（Lawrence & Lawrence，2016年）。研究表明，母亲补充维生素C并不会显著提高母乳中的维生素C含量（Sneed等人，1981年；Byerley & Kirksey，1985年）。尽管在我们的研究中，产后24周内母乳中的维生素C含量有上升趋势，但这种趋势并不显著（p-adj=5.03E-01）。产后2-12周时叶酸含量最低，为19.0 µg/mL（10.9-33.8 µg/mL），产后13-16周上升至24.2 µg/mL（13.2-33.8 µg/mL），随后在产后17-24周稳定在23.2 µg/mL（13.2-38.5 µg/mL）。Luthfor等人（2004年）测量发现，初乳、过渡期母乳（产后第2周）和成熟母乳（产后第4周）中的维生素C含量分别为平均35.2 µg/mL、32.5 µg/mL和30.3 µg/mL。Hoppu等人（2005年）的研究发现，没有饮食限制的母亲母乳中的维生素C含量可高达64 µg/mL，而有食物过敏反应的母亲（对柑橘类水果、坚果和蔬菜等食物）仅为55 µg/mL。母乳中维生素C含量低与婴儿皮肤过敏风险增加有关（p=0.038，Hoppu等人，2005年）。值得注意的是，母乳样品中维生素C含量的测定受储存条件的影响很大。Buss等人（2001年）发现，母乳在冷冻条件下储存1个月后含量减少三分之一，而在冷冻条件下储存两个月后含量增加三分之二。
维生素D有两种主要形式：维生素D2（麦角钙化醇），主要来源于真菌；维生素D3（胆钙化醇），由人类和其他动物体内合成。维生素D2是从其前体麦角甾醇在紫外线B（UV-B）照射下产生的，常用于膳食补充剂中。维生素D3是在皮肤中从7-脱氢胆固醇经过UV-B照射后合成的。虽然维生素D的生物活性形式是D2和D3的羟基化代谢物，但循环中的25-羟基维生素D被广泛用作血浆中维生素D状态的可靠标志物（Saenger等人，2006年；Mazahery & von Hurst，2015年）。在本研究中，我们仅测量了母乳中的25-羟基维生素D3（25-OH-D3）含量。我们观察到，在三个哺乳阶段中，25-OH-D3的含量没有显著变化，其中产后2-12周的中位数为0.8 ng/mL（2.0 nM），产后13-16周为0.9 ng/mL（2.3 nM），产后17-24周为0.8 ng/mL（2.0 nM）。
Jones等人（2025年）验证了一种LC-MS/MS方法，用于测定冈比亚妇女母乳中的维生素D代谢物，他们在哺乳后期（大约产后14周）报告了胆钙化醇和25-羟基维生素D的浓度。在那项研究中，胆钙化醇是母乳中主要的维生素D形式，而25-羟基维生素D的含量显著较低，因此可以与我们的测量结果直接比较。他们的综述进一步总结了全球母乳中维生素D代谢物的数据，并强调了地理差异性（Jones等人，2023年）。现有证据表明，母乳中的胆钙化醇浓度通常低于10 nM（4.01 ng/mL），范围在0.1至7.8 nM之间（0.04-3.12 ng/mL）。Ferreiro-Vera等人（2013年）在一个小规模西班牙母亲群体中观察到较高的胆钙化醇浓度（平均约16 nM；6.41 ng/mL），这可能表明UV-B照射对母乳中维生素D含量有影响。Dawodu等人（2015年）进一步探讨了母亲日晒与维生素D状态之间的关系，他们检查了不同地理位置的母亲和婴儿血清25-羟基维生素D浓度与日晒指数之间的关联。他们的发现表明，更多的日晒通常与母亲维生素D状态改善以及婴儿血清25-羟基维生素D水平升高有关。然而，单靠母乳往往无法满足婴儿的维生素D需求，特别是在母亲日晒不足的情况下，因此需要继续重视膳食强化和补充策略来预防婴儿维生素D缺乏和佝偻病。由于母乳中的胆钙化醇通常比25-羟基维生素D更丰富，同时测量这两种形式可以为婴儿的维生素D摄入提供更全面的评估。
由于需要确保早产儿的安全，母乳的处理过程不同于原始母乳。Holder方法（HoP）是最常用的方法，它将母乳加热至62.5°C持续30分钟。虽然这种方法能有效去除病原体，但可能会影响某些生物活性成分。大多数B族维生素（B1、B2、B3、B12）和维生素C保持稳定，不过B6有中等程度的损失（11-16%）。值得注意的是，HoP似乎会增加活性胆钙化醇（维生素D3）的含量，可能是通过促进其前体形式的转化实现的。这些发现表明，影响营养素保留的因素不仅仅是温度，还包括处理时间（Peila等人，2016年；Wesolowska等人，2019年；Davis等人，2025年）。
本研究的结果应在其方法学优势和固有局限性范围内进行解读。尽管所有中心的样本都在相同的哺乳阶段采集，但由于各国和各母乳库之间的样本分布不均，无法进行有力的地理比较。然而，纳入多个地区的样本提高了数据集的外部相关性，增强了关于母乳中维生素浓度的结论的普遍性。此外，使用先进的液相色谱-质谱（LC-MS）技术具有高灵敏度和特异性，可以准确测量多种维生素，从而全面分析母乳中的维生素谱型。189个母乳样本在三个产后时间点的较大样本量进一步提高了结果的可靠性，并使得能够评估维生素含量的时间变化。然而，该研究也存在一些局限性。不同国家之间的招募程序和伦理框架的差异可能导致人群异质性，从而影响研究结果的一致性。此外，研究依赖于特定的样本收集和处理协议，这可能会引入分析前变异性，进而影响测得的维生素含量。例如，冷冻和解冻过程以及从收集到分析之间的时间可能会影响某些不稳定维生素的稳定性。
总之，本研究表明，在哺乳期间，捐赠母乳中的维生素组成会发生特定维生素的变化，某些B族维生素有明显的变化，而维生素C和D相对稳定。通过采用纵向的、多维生素的分析方法，我们的发现有助于更详细地了解哺乳前六个月母乳中微量营养素的动态变化。这些数据为母乳的营养评估提供了有价值的参考，并可能为优化其在早产儿和脆弱婴儿群体中的使用提供依据。未来研究需要结合其他微量营养素和临床结果，以全面阐明母乳中维生素变化的营养意义。
本研究得到了波兰国家学术交流机构（项目编号：PPI/APM/2019/1/00095）的支持。资金来源未参与研究设计、数据收集、分析、报告撰写或决定发表文章的决定。
鉴于问题的敏感性，参与者被告知所有原始数据将保密且不予共享。
本研究符合伦理标准，并获得了相关机构审查委员会的批准（批准编号：AKBE/39/2020、2021.0597、169849，日期2021年3月8日）。所有参与者在纳入研究前均签署了知情同意书。本研究中对人类参与者实施的所有程序均符合所在机构和/或国家研究委员会的伦理标准，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订案或类似的伦理规范。
**CRediT作者贡献声明：**
- Mariusz Radkiewicz：撰写、审阅与编辑；撰写初稿；资料准备；方法论研究；数据分析。
- Tonetto Paola：研究设计；概念框架构建。
- Molas Aleksandra：数据收集与整理。
- Sottemano Stefano：数据收集与整理。
- Agnieszka Bzikowska-Jura：撰写、审阅与编辑；撰写初稿；数据分析；概念框架构建。
- Sinkiewicz-Darol Elena：数据收集与整理。
- Królak-Olejnik Barbara Krolak-Olejnik：数据收集与整理；概念框架构建。
- van Goudoever Johannes：数据收集与整理。
- Gawronska Małgorzata：数据收集与整理；概念框架构建。
- Gawel Paweł：数据收集与整理。
- Drazkowska Izabela：数据收集与整理。
- Van Den Akker Chris：数据收集与整理。
- Gandino Serena：数据收集与整理。
- Wesolowska Aleksandra：撰写、审阅与编辑；撰写初稿；研究指导；方法论研究；概念框架构建。
- Bertino Enrico：研究设计；概念框架构建。
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