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在癌症免疫治疗中，肽-主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）复合物越来越多地被用作精确的治疗靶点。例如，T细胞受体（T-cell receptor, TCR）工程化的T细胞、肽疫苗和TCR模拟抗体利用
在癌症免疫治疗中，肽-主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）复合物越来越多地被用作精确的治疗靶点。例如，T细胞受体（T-cell receptor, TCR）工程化的T细胞、肽疫苗和TCR模拟抗体利用了对呈递于人白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）分子上的肿瘤特异性抗原（Tumor-Specific Antigen, TSA）或肿瘤相关抗原（Tumor-Associated Antigen, TAA）的直接识别，为清除恶性细胞提供了高度特异且有效的方法。传统的免疫肽组学研究依赖肿瘤组织样本来鉴定可靶向的肽；然而，组织的可及性和肿瘤异质性仍然是主要的限制。液体活检，包括循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）、细胞外囊泡（Extracellular Vesicle, EV）和游离核酸，是捕获肿瘤来源材料的一种微创替代方案。近期的方法学改进使得能够将免疫肽组学应用于这些循环生物标志物，以分析血液中HLA结合的肽。将免疫肽组学与液体活检相结合，可以扩大精准肿瘤学的范围，以微创方式为开发和监测个性化免疫疗法提供动态的、患者特异性的抗原呈递信息。
论文主体内容总结
1. 引言
癌症因其在患者间及肿瘤内部的遗传、表观遗传和蛋白质组学特征的高度异质性，仍然是治疗最具挑战性的疾病之一，是全球第二大死亡原因。免疫疗法通过利用宿主免疫系统识别和清除肿瘤细胞，已彻底改变了癌症治疗，但其成功与否关键在于肿瘤特异性抗原（TSA）的精确识别，TSA是免疫识别的分子线索。因此，确定肿瘤细胞呈递的肽对于开发靶向且有效的免疫疗法至关重要。然而，这受到实际和技术限制的阻碍。传统组织活检虽然能直接获取肿瘤材料，但具有侵入性，且通常不适合重复监测，并且可能因肿瘤不同区域具有不同的抗原谱而无法捕捉完整的肿瘤异质性。此外，传统的蛋白质组学和基因组学方法可能会忽略非经典或隐蔽肽，而这些肽可能是TSA的重要来源。这些挑战凸显了对能够实时洞察抗原呈递和肿瘤演变的动态、患者特异性方法的需求。液体活检已发展成为组织采样的一种微创替代方案，用于检测和表征生物体液（如血液、尿液和脑脊液）中的肿瘤来源成分。通过系统性地捕获肿瘤材料，液体活检补充了基于组织的研究，并为了解肿瘤异质性、克隆进化和免疫相关抗原呈递提供了一个实时窗口。肿瘤细胞可能产生数千种蛋白质，但只有一部分被处理和呈递在MHC分子上供免疫系统识别。免疫肽组学通过实现大规模分析MHC结合肽（统称为免疫肽组，是肿瘤蛋白质组和免疫监视之间的功能界面），弥补了这一空白。通过分析从CTC和EV等液体活检获得的肿瘤来源分析物中的MHC呈递肽，免疫肽组学可以识别TSA，包括可能被传统蛋白质组学和基因组学方法遗漏的经典和非经典序列。这些抗原可作为个性化免疫疗法的可操作靶点。免疫肽组学和液体活检的结合利用了两者的优势。具体而言，它通过实现微创、纵向采样来克服基于组织研究的局限性，这种采样反映了实时肿瘤动态和治疗反应。它还允许动态监测抗原呈递，捕捉治疗过程中可能演变的肿瘤异质性和免疫逃逸机制。通过利用液体活检的可及性和免疫肽组学的分子特异性，可以实时识别患者特异性治疗靶点，以提高免疫疗法的精准性和有效性。
2. 免疫肽组
自我识别是免疫反应的基石。通过MHC分子呈递自身肽，在胸腺中发育的T细胞被教导区分自身和非我。对自身肽反应过强的T细胞被清除以防止自身免疫，而反应较弱的则被保留以识别病原体。这个过程称为胸腺选择，塑造了一个对自身耐受并识别外来抗原的T细胞库。此外，一定程度低亲和力的自身反应性被保留，因为它增强了T细胞对正常肽细微偏差的敏感性。外周机制，包括失能、调节性T细胞对免疫过度反应的抑制和克隆清除，进一步控制潜在的自反应T细胞。这种对自我的识别提供了一个必要的“正常性参考点”。因此，免疫系统可以将所有呈现异常肽（例如，由病毒感染、突变或肿瘤应激导致）的细胞识别为危险并予以清除。同时，自然杀伤细胞通过MHC I进行自我识别，将其作为抑制信号以避免攻击健康细胞，同时破坏那些失去这种呈递的细胞。最近的研究表明，CD8+T细胞可以通过其NKG2D受体与肿瘤细胞表达的NKG2D配体之间的相互作用，消除缺乏MHC-I的肿瘤细胞，确保不依赖于抗原的细胞毒性。总之，这些协调的过程确保了免疫耐受和有效监视之间的微妙平衡，防止自身免疫，同时能够防御感染和转化细胞（如癌细胞）。免疫肽组是MHC分子在细胞表面呈递的肽的总和，作为免疫系统区分自我和非我、检测细胞异常的信号。在MHC I类分子的正常抗原呈递背景下，细胞内自身蛋白质被蛋白酶体降解为小肽，然后通过抗原加工相关转运蛋白（Transporter associated with Antigen Processing, TAP）转运到内质网。在那里，它们被装载到MHC I类分子上，这些肽-MHC I复合物被转运到质膜，在细胞表面暴露。这种呈递使成熟的CD8+T细胞能够持续监测细胞完整性。任何由突变、细胞应激或病毒感染引起的异常肽都能触发CD8+T细胞的激活和细胞的靶向清除。MHC II类分子的抗原呈递主要由树突状细胞、巨噬细胞和B细胞等抗原呈递细胞执行。这些细胞通过内吞作用、吞噬作用或微胞饮作用将外源性抗原内化到内体和溶酶体中，在那里它们被特定蛋白酶降解成肽。MHC II类分子在内质网中合成，并与一个占据肽裂隙的恒定链肽（class II-associated invariant chain peptide, CLIP）结合，防止肽过早装载。MHC-II-CLIP复合物被转运到特化的MHC II类区室，在那里HLA-DM分子伴侣催化CLIP与内吞作用来源的抗原肽的交换。一旦装载完成，肽-MHC II类复合物被转运到质膜并在细胞表面暴露，被CD4+T细胞识别。这种相互作用触发T细胞活化，促进细胞因子产生、分化为专门的辅助亚型，并刺激B细胞产生抗体。在肿瘤中，抗原呈递机制常常发生改变。TAP1/TAP2可能被下调、突变或被致癌或表观遗传信号抑制。这导致肽在细胞质中积累，并减少其装载到MHC I分子上。这些改变导致抗原呈递减少、T细胞浸润减少，并与不良预后相关的免疫逃逸。肿瘤细胞还可以影响内质网中调整肽长度的ERAP1/ERAAP的表达，从而改变HLA分子呈现的最终库。分子伴侣蛋白（如钙联蛋白、钙网蛋白、tapasin、ERp57）的表达改变导致肿瘤肽的呈递不稳定且效果较差。所有这些改变共同导致肽库的重塑、呈现抗原多样性减少，并选择不能代表实际肿瘤含量的肽。在生理条件下，由T细胞和活化的自然杀伤细胞产生的干扰素（Interferon, IFN）-γ激活细胞内的转录程序。该程序促进I类HLA分子的表达，导致呈递肽密度增加、T细胞对细胞的检测能力增强，以及更丰富、更“可见”的免疫肽组。IFN-γ通过用β1i (LMP2)、β2i (MECL-1) 和β5i (LMP7) 替换蛋白酶体的组成型亚基来诱导免疫蛋白酶体。生成的肽与具有疏水C末端（有利于HLA）的MHC-I分子更兼容。然而，在肿瘤中，IFN通路经常发生改变，导致抗原呈递减少。一些肿瘤在微环境中暴露于IFN-γ，但对其效应产生抵抗。此外，IFN压力施加免疫选择，消除IFN敏感克隆，并选择具有IFN反应缺陷或低HLA呈递的克隆。因此，免疫肽组变得贫乏，导致CD8+T细胞的识别减少，肿瘤逃逸增加。除了这种肽库的整体减少和重塑之外，肿瘤进化还可能导致所呈递肽性质的定性转变。最近的证据表明，所谓的隐蔽肽，源自非经典基因组区域（例如，非经典开放阅读框、uORF、先前未翻译的序列）也被呈递，并可能在健康和疾病中发挥作用。在许多肿瘤类型中，大多数癌症特异性肽并非来自经典的突变蛋白，而是来自这些非经典区域。这些隐蔽肽代表了新抗原的潜在来源，可用于免疫疗法和疫苗，特别是在突变率低、经典新抗原稀少的肿瘤中。然而，许多隐蔽肽不稳定或丰度低，因此难以检测。此外，尚不清楚它们是否在所有情况下都具备足够的免疫原性（即能够触发有效的T细胞反应）。质谱和生物信息学的最新进展彻底改变了对这种肽库的研究，特别是预测算法的发展，这些算法整合了质谱数据，以更好地根据每种HLA等位基因预测呈现的库。这些预测工具通过结合计算模型和实验数据来估计肽与特定MHC分子结合的可能性。
3. 免疫肽组学的生物来源
在免疫肽组学中，如同在蛋白质组学中一样，生物来源的质量至关重要，因为它直接影响肽鉴定和定量的准确性与可重复性。高质量的样本确保检测到全面且有代表性的肽库，这对于识别TSA和新抗原至关重要。高质量的样本特点在于没有不受控制的蛋白水解降解，且在免疫沉淀前保留了HLA-肽复合物。样本质量也体现在组织的保存和健康组织污染方面。样本必须含有足够量的HLA材料才能被液相色谱-串联质谱检测到。除了样本本身的质量，技术因素（如免疫沉淀策略）也会影响检测到的肽库。分析方法的进步，包括使用大规模多HLA谱库和数据非依赖性采集，可以改善肽的鉴定，特别是在材料有限的样本中。总的来说，这些因素突出了生物来源质量与方法学优化之间的相互作用，以确保稳健且具有临床相关性的免疫肽组学分析。使用两种主要的材料来源：组织活检，目前是提供直接接触肿瘤微环境的主要来源；以及液体活检，一种用于实时监测肿瘤来源成分的非侵入性动态方法。
3.1. 组织活检
组织活检长期以来一直被视为癌症诊断、分子特征描述和生物标志物发现的金标准，因为它们提供了直接接触肿瘤微环境的途径。然而，尽管具有诊断和研究价值，组织活检是一种侵入性操作，通常不适合连续采样，特别是在患有转移性疾病或身体虚弱的患者中。此外，癌症的自然病程涉及远处转移的形成和治疗耐药性的出现。然而，单次组织活检样本量有限，仅捕获特定时间点和特定位置的肿瘤分子和免疫学特征。在免疫肽组学中，这些局限性变得更加重要。有限的可用组织量可能限制需要大量样本输入进行HLA免疫沉淀和下游质谱分析的工作流程。样本制备和LC-MS灵敏度方面的最新进展使得能够从更小的组织量中鉴定出数千个HLA结合肽，从而提高了分析深度和可重复性。尽管如此，尽管有这些技术进步，活检的侵入性、由肿瘤异质性引起的空间偏倚以及重复采样的可行性有限，限制了它们在纵向或实时监测肿瘤演变方面的应用。这些挑战增加了对液体活检方法的兴趣，液体活检提供了一种捕获肿瘤来源材料和动态监测抗原呈递的微创途径。
3.2. 液体活检
液体活检包含一系列在生物体液（如血液、尿液和脑脊液）中检测、分离和表征肿瘤来源成分的方法。它提供了传统组织活检的微创替代方案，并且允许实时监测肿瘤异质性和克隆进化。通过此策略可获取的分析物包括游离肿瘤DNA、核酸、蛋白质和代谢物，以及CTC和EV，这些提供了对肿瘤生物学的功能洞察。这些生物标志物代表了肿瘤相关抗原和肽的独特来源，从而为免疫肽组学与液体活检的整合创造了新的机会。CTC是从原发或转移性肿瘤部位脱落到血流中的侵袭性恶性细胞，因此直接代表了实体瘤的细胞复杂性。然而，它们的极端稀有性构成了一个主要的技术挑战。尽管如此，富集和单细胞分析技术的进步使得能够对它们进行详细的分子表征。与游离肿瘤DNA不同，CTC保留了肿瘤完整的基因组、转录组和蛋白质组景观，为研究异质性、转移机制和治疗耐药性提供了一个有价值的平台。此外，它们的活力允许进行体外和体内功能研究，并且肿瘤相关表面和细胞内抗原的表达使它们成为液体活检框架内免疫肽组学分析的新兴来源。EV，包括外泌体和微囊泡，是由几乎所有细胞类型（包括肿瘤细胞）主动释放到生物体液中的纳米级膜结合颗粒。与极其稀少的CTC不同，EV的数量非常庞大，每毫升血浆中有数百万到数十亿，使其成为高度可及的肿瘤来源材料来源。EV封装了复杂的核酸、蛋白质、脂质和代谢物，从而反映了其来源细胞的分子状态和功能活动。重要的是，EV还携带MHC相关肽，包括TAA和源自肿瘤限制性遗传改变（如体细胞突变）的TSA。这些特征将EV定位为免疫调节的潜在介质和免疫肽组学分析的有希望的候选者。由于它们的丰度、循环中的稳定性以及可重复采样的能力，EV对于整合到液体活检方法中特别有吸引力，可用于生物标志物发现和开发新的免疫治疗策略。此外，血浆样本包含一个复杂且动态的蛋白质组，源自健康细胞和肿瘤细胞的主动分泌，也源自细胞死亡（坏死、凋亡、细胞裂解）后的被动释放。血浆蛋白质组主要包括白蛋白和免疫球蛋白，但也包括细胞因子和炎症相关蛋白。在循环蛋白中，表面HLA I类分子可被蛋白酶切割，从而将HLA-肽复合物释放到循环中。这个过程在炎症和肿瘤发展过程中常常增加。HLA分子也可以作为缺乏跨膜结构域的可溶性亚型被分泌。然而，这些HLA分子保留结合肽的能力。由于sHLA分子来源于所有细胞类型，它们的谱是高度动态且依赖于环境的，根据免疫激活水平、细胞应激和癌变而变化。为了清晰起见，提供了传统基于肿瘤组织的免疫肽组学和液体活检方法的比较概述。
4. 新的治疗方法
近年来，对MHC分子呈递的肽库（即免疫肽组）的研究为免疫肿瘤学开辟了新的治疗前景。通过识别肿瘤细胞表达的肽（来自常规蛋白质或非经典、隐蔽区域），现在可以设计精确靶向恶性细胞的个性化治疗策略。这些方法包括开发个性化癌症疫苗、改造能够识别特定新抗原的T细胞，以及设计针对肽-MHC复合物的抗体。所有这些创新都基于整合质谱数据和预测生物信息学工具，以精确绘制免疫原性肽库并刺激针对肿瘤的免疫反应。能够识别肿瘤新抗原的T细胞工程是个性化免疫疗法中最有前途的进展之一。新抗原是由携带肿瘤特异性突变的癌细胞特异性产生且正常组织中不存在的肽。新抗原由MHC分子呈递在肿瘤细胞表面。它们的鉴定依赖于整合了免疫肽组学、基因组测序和计算预测的流程，以优先考虑对肿瘤抗原具有特异性的TCR。然后，这些受体可以被引入患者的T细胞，创造出在临床前模型和选定的临床研究中显示出能有效靶向和消除肿瘤细胞的修饰T细胞。在一项对14种癌症类型和29种正常组织的大规模分析中，综合分析鉴定并优先考虑了2523个候选新肽。其中一部分新肽的实验验证表明，它们可以激活CD8+T细胞，选择性消除肿瘤细胞而不影响健康组织。计算优先级流程，如MaNeo，用于整合肽序列基序、生化特征和质谱数据中的HLA呈递信息，以对新抗原候选者进行稳健排序。此外，当基因组和免疫肽组学数据与机器学习算法结合时，新抗原的识别和优先级排序得到显著改善。例如，NeoDisc流程结合了基因组、转录组和免疫肽组学数据，用于识别免疫原性EB病毒抗原和高置信度的TAA，并使用T细胞反应性测定进行了验证。重要的是，这种使用同一患者多个样本的整合方法也揭示了肿瘤异质性以及抗原呈递和加工机制的改变，包括HLA丢失和β2-微球蛋白突变，这可能会限制免疫反应。这些观察表明，当新抗原存在时，它们在HLA上的呈递可能在某些肿瘤病灶中发生改变，影响免疫疗法的潜在成功。除了突变来源的新抗原，另一项基于免疫肽组学的研究发现了由异常翻译产生的、可由治疗诱导、广泛表达且高度肿瘤特异性的新表位，从而为过继性T细胞疗法提供了候选。这种方法揭示了由HLA-A24:02和其他常见HLA等位基因呈现的共享新表位。这表明，结合多个TCR的疗法可能潜在地克服肿瘤异质性并降低免疫逃逸的风险。作者还强调了几个重要的局限性。具体而言，这些新表位的生成取决于特定的细胞条件，这可能导致其表达的可变性。此外，尽管这些肽在正常组织中基本不存在或检测极少，但不能完全排除交叉反应的可能性，需要进一步评估。最后，这些结果主要基于临床前实验模型，其临床转化性仍有待证实。与经典抗原或罕见的体细胞新抗原相比，免疫肽组学可以促进选择那些尽管肽-HLA复合物稳定性中等但仍持续呈递的候选靶点，尽管这仍依赖于实验和临床验证。对癌细胞、肿瘤基质和相应健康组织中HLA I类分子呈递的肽的比较分析发现，在肿瘤基质细胞中富集但在正常组织中不存在或表达极低的肽。从VI型胶原蛋白α3链蛋白衍生的一种肽被鉴定为在各种癌症类型中由肿瘤基质细胞特异性且丰富地呈递。分离出了针对该肽-HLA复合物的特异性TCR。转导了这些TCR的T细胞显示出对表达该肽的肿瘤基质细胞的强烈反应性，而对健康组织没有明显的细胞毒性。在临床前体内模型中，这些COL6A3特异性TCR表达的T细胞通过选择性靶向肿瘤基质来减少肿瘤生长。这项研究表明，对肿瘤微环境（而不仅仅是癌细胞）进行定量免疫肽组学分析，可能有助于解决肿瘤异质性并提高细胞免疫疗法的疗效，尽管临床验证仍是必要的。蛋白质基因组学框架通过整合全外显子组或全基因组测序、转录组和基于质谱的免疫肽组学数据，直接将肿瘤突变与呈递的肽联系起来，从而进一步加强了新抗原的发现。这些方法一致证明，只有一小部分通过基因组测序预测的新抗原实际上呈递在MHC分子上，强调了实验性肽验证的重要性。大规模流程，如NeoDisc及相关工作流程，改善了肿瘤特异性和非经典抗原的识别，包括源自替代阅读框和未翻译区域的肽，这些是单独测序无法检测到的。当与基于机器学习的优先级排序相结合时，这些流程改善了在异质性肿瘤和不同HLA背景下对免疫原性候选者的排序，从而增强了个性化癌症疫苗的转化潜力。重要的是，免疫肽组学也提供了肿瘤演变和免疫逃逸的功能性读数。纵向分析表明，肿瘤细胞经历免疫编辑，导致免疫原性表位丢失，并选择具有受损抗原加工或呈递的变异体。治疗干预，包括免疫检查点阻断，可以进一步重塑免疫肽组，导致新抗原可见性降低和获得性耐药。因此，免疫肽组学不仅允许抗原发现，还能捕捉免疫压力下的动态进化肿瘤轨迹。免疫肽组学与单细胞和空间转录组学的整合进一步细化了对肿瘤抗原景观异质性的理解。单细胞多组学研究揭示了具有不
