菲律宾珍珠贝(Ruditapes philippinarum)中抗氧化肽的致敏性评估:BALB/c小鼠过敏模型、被动皮肤过敏反应验证以及与过敏原相关的肽残留分析

时间:2026年5月16日
来源:Food Bioscience

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刘立冲|赵正卓|吴碧芬|陈大森|戴春杰|任敬楠|杨青|王玲|陈一杰|徐峰华中农业大学食品科学技术学院,武汉,430070,中国摘要Ruditapes philippinarum是抗氧化肽的重要天然来源,富含芳香化合物和疏水氨基酸。它也是亚洲广泛分布的致敏性食物,尤其是在中国。在本

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刘立冲|赵正卓|吴碧芬|陈大森|戴春杰|任敬楠|杨青|王玲|陈一杰|徐峰
华中农业大学食品科学技术学院,武汉,430070,中国

摘要

Ruditapes philippinarum是抗氧化肽的重要天然来源,富含芳香化合物和疏水氨基酸。它也是亚洲广泛分布的致敏性食物,尤其是在中国。在本研究中,我们生产了这些抗氧化肽,并建立了对其致敏潜能的评估方法。采用羟基自由基清除率(HR)和水解程度(DH)作为蛤肉酶水解的指标。通过响应面法(RSM)优化了酶水解过程:温度:50.26°C;酶水解时间:3.19小时;总酶剂量:3267.06 U/g;固液比:1:4。在最佳条件下,蛤肉水解物(CH)的HR和水解程度分别达到77.35%±0.34%和64.64%±1.22%。随后,通过联合2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)自由基清除和Fe2+螯合率进一步验证了CH的抗氧化活性。在0.1 mg/mL的浓度下,CH的ABTS自由基清除率和Fe2+螯合率分别为85.87%±0.40%和21.38%±2.88%。接着,使用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和被动皮肤过敏试验(PCA)评估了CH的免疫调节活性。通过生物信息学软件预测了蛤肉中的过敏原表位。然后,使用Q-Exactive HF质谱仪鉴定了蛤蛋白(CP)和CH中的肽。最终,仅鉴定出一个残留的预测过敏原表位77RVTEAEDEIK86。结果表明,在最佳处理条件下获得的CH的致敏性显著降低。

引言

在正常情况下,体内通过氧化反应产生的自由基和活性氧物种(ROS)的产生和清除是平衡的(Wu等人,2019年)。ROS是在生物体的代谢过程中产生的(Mansoor等人,2022年)。氧化应激是由于ROS和自由基的异常积累引起的(Agbor等人,2018年)。同时,细胞抗氧化防御系统的功能可能因压力、睡眠剥夺和营养不良而减弱(Akbari等人,2022年)。因此,人们越来越关注抗氧化剂的研究(Yang等人,2020年)。目前,抗氧化剂主要来源于合成化合物,如丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯和丙基没食子酸(Xu等人,2024年)。然而,也发现了一些挑战,包括稳定性差、成本上升、多样性有限以及潜在的毒性问题(Agrawal等人,2019年)。来自海洋食物来源的肽的抗氧化活性已得到验证,例如鲍鱼内脏(Je等人,2015年)、罗非鱼(Zhang等人,2020年)、沙丁鱼(Jemil等人,2017年)和虾(Xia等人,2022年),其作用包括清除ROS、还原化学物质、抑制脂质和蛋白质氧化以及保护细胞)。
蛤蜊是全球广泛分布且具有经济价值的双壳类动物。人们越来越关注它们的潜在生物活性成分(Belenguer等人,2020年)。蛤蜊富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、维生素和矿物质(Venugopal和Gopakumar,2017年)。从金枪鱼蛋白中分离出的肽AGLYYPGA、GEPGAG和LPGGGPVL的抗氧化活性得到了验证(Guo等人,2024年)。中国是全球最大的蛤蜊生产和消费国之一,占全球产量的70%。Ruditapes philippinarum(马尼拉蛤)是中国四种主要经济价值高的养殖贝类之一(Huan等人,2021年)。它是天然抗氧化肽的重要来源,其蛋白质富含芳香和疏水氨基酸(Jin等人,2024年)。
食物过敏是一个广泛讨论的公共卫生问题,近年来其发病率稳步上升(Ayuso等人,2009年)。在马尼拉蛤中发现了热带肌球蛋白(TM),并被证实是一种稳定的致敏蛋白(Kamath等人,2013年)。此外,贝类过敏通常是终身的,并且是食物引起的全身性过敏反应的主要原因(Leung等人,2021年)。对蛤蜊TM进行了超声波辅助的高压处理,发现其致敏性和消化性受到其二级和三级结构变化的影响(Chen等人,2023年)。Zhao(2022年)发现煮熟的虾肉比生的虾肉具有更高的致敏性。加热改变了虾肉中像TM这样的过敏原的结构,降低了免疫球蛋白E(IgE)的结合能力。许多研究表明,酶水解不仅可以增强蛋白质的某些功能特性并产生分子量较低的生物活性肽(Sunde等人,2021年),还可以改变过敏原的线性或非线性表位,从而降低其致敏性(Xiong等人,2025年)。在一项相关研究中,从南极磷虾中分离并纯化了抗氧化肽成分,并系统评估了这些成分的致敏性。结果表明,这些抗氧化肽具有较低的IgE结合能力,并对大鼠嗜碱性白血病细胞系2H3(RBL-2H3)细胞的脱颗粒作用较弱(Ding等人,2023年)。在酶水解过程中,IgE反应性蛋白或肽被分解为小肽,从而降低了它们的致敏性(Cui等人,2024年)。
在本研究中,生产出了具有高抗氧化活性和高水解程度的水解物,并优化了酶法。通过生物信息学比较了从蛤蛋白和蛤肉水解物中获得的肽序列。随后,使用BALB/c小鼠模型获得了致敏血清。通过PCA试验、间接ELISA和质谱分析验证了酶水解产物的致敏性降低。因此,本研究表明,从马尼拉蛤中提取的水解物具有作为天然抗氧化剂和低致敏性食品成分的潜力。

节片段

材料

蛤蜊是从当地海鲜市场(中国武汉)购买的。碱性蛋白酶和中性蛋白酶从Yuanye生物技术有限公司(中国上海)购买,而风味蛋白酶和木瓜蛋白酶则从Solabio科技有限公司(中国北京)获得。双辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒从Biyuntian生物技术有限公司(中国上海)获得。

不同蛋白酶及其组合的水解能力

如图1A所示,测量了每种马尼拉蛤水解物的HR和DH。虽然风味蛋白酶水解物和中性蛋白酶水解物的水解程度分别为27.03%±1.31%和26.04%±2.13%,但风味蛋白酶水解物的HR最高(69.21%±0.25%)(p<0.05)。因此,确定风味蛋白酶为最佳蛋白酶。有研究表明,抗氧化肽与

结论

在本研究中,通过复杂的酶水解方法制备了马尼拉蛤的抗氧化肽。通过优化水解条件,获得了最高的HR和DH水解物相对产率。通过基于不同原理的抗氧化测试验证了这些水解物的抗氧化活性。此外,还建立了BALB/c小鼠过敏模型并进行了验证。随后,使用抗原-抗体结合减少

CRediT作者贡献声明

徐峰:撰写 - 审稿与编辑、资源提供、概念构思。王玲:撰写 - 审稿与编辑、软件使用。陈一杰:撰写 - 审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。赵正卓:撰写 - 初稿撰写、软件使用、实验研究、数据管理。刘立冲:撰写 - 初稿撰写、软件使用、实验研究、数据管理。陈大森:软件使用、数据管理。吴碧芬:验证、实验研究。任敬楠:撰写 - 审稿与编辑,

未引用参考文献

Chen等人,2023年;Jia等人,2025年;Lin等人,2023年;Liu等人,2024年;Miao等人,2018年;Wang等人,2022年;Yu等人,2020年;Zhao等人,2022年。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

如需合理请求,可从相应作者处获取支持本研究结果的数据。

遵守伦理标准

所有实验程序均获得了华中农业大学动物福利伦理委员会的批准(中国武汉,HZAUMO-2025-0336)。本研究的动物实验部分遵循ARRIVE(动物研究:体内实验报告)指南和1986年《动物(科学程序)操作法》的规定进行。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

如需合理请求,可从相应作者处获取支持本研究结果的数据。

遵守伦理标准

所有实验程序均获得了华中农业大学动物福利伦理委员会的批准(中国武汉,HZAUMO-2025-0336)。本研究的动物实验部分遵循ARRIVE(动物研究:体内实验报告)指南和1986年《动物(科学程序)操作法》的规定进行。

手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时,作者使用了DeepL来改进语言。使用该工具后,作者根据需要审查和编辑了内容,并对出版物的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划(授权号:2023YFF1104305)、湖北省自然科学基金(授权号:2024AFA096)和中央高校基本研究经费(授权号:2662025SPPY004)的支持。

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