马波|梁增辉|傅丽萍|马彦彪|孙庆和|吕旭晨
沧州人民医院，介入血管外科
中国沧州061000
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设计了十二种苯肼希夫碱衍生物（），这些衍生物在芳香醛基团上进行了系统性的变化，以评估其抗炎、抗血小板和体外抗血栓活性。其中，化合物（4-氯苯肼和呋喃-2-醛的缩合产物）被确定为最有前途的候选化合物，显示出中等选择性的COX-1抑制作用（IC50 = 1.63 µM，选择性指数 = 8.87）以及中等的5-LOX抑制作用（IC50 = 10.63 µM）。在LPS刺激的巨噬细胞中，该化合物能够浓度依赖性地抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2的释放。它还能抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集（IC50分别为5.48 µM和4.52 µM），降低血小板活化标志物CD62P和PAC-1的表达，并延长 clotting时间，同时降低血栓弹性图中的血栓强度。在平行板流动室的动脉剪切条件下，该化合物能够以浓度依赖的方式显著减弱血栓形成。重要的是，在体外血栓溶解模型中，50 µM的该化合物将低剂量尿激酶（100 IU/mL）的溶栓率从35.0%提高到了45.2%，凸显了其增强溶栓的潜力。初步的ADME分析显示，该化合物在血浆中有中等程度的蛋白结合能力（89.3%），并在肝微粒体中的代谢半衰期为0.75小时。本研究提供了苯肼希夫碱上芳香醛取代基的第一个系统结构-活性关系分析，并确定了该化合物作为具有抗炎、抗血小板和增强溶栓活性联合效果的候选化合物。这些发现支持了该化合物作为支架内血栓溶解辅助药物的潜力，有待进一步的体内疗效和安全性研究。
1. 引言
静脉血栓栓塞（VTE），包括深静脉血栓形成和肺栓塞，是继心肌梗死和中风之后第三大心血管疾病相关死亡原因。它对人类健康构成严重威胁，尤其是在老年人群中的发病率显著增加。目前，VTE的标准治疗主要依赖于抗凝药物（如直接口服抗凝剂、华法林和肝素）以及机械干预措施，如溶栓或外科溶栓术。然而，这些传统疗法存在显著局限性：抗凝治疗会增加大出血的风险，并有许多禁忌症；同时，现有的方法在促进血栓自发溶解和预防血栓复发方面效果有限。因此，迫切需要开发具有新作用机制、改善安全性并能够有效干预整个血栓形成过程的新疗法。近年来，基础研究的进展为学术界提供了对VTE发病机制的新理解，“血栓炎症”概念被提出，揭示了炎症与凝血系统之间复杂的“双向相互作用”。一方面，炎症反应可以激活凝血系统：活化的炎症细胞和受损的内皮细胞高表达组织因子，启动外源性凝血级联反应；同时，炎症介质如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）会下调天然抗凝途径的功能，共同造成高凝状态。另一方面，凝血系统的激活又会加剧炎症反应：活化的凝血因子和血小板不仅直接参与血栓形成，还能通过激活蛋白酶激活受体诱导内皮细胞和单核细胞表达黏附分子和促炎细胞因子，形成一个恶性循环。在这个血栓炎症网络中，巨噬细胞起着中心和多方面的作用。暴露于脂多糖（LPS）等促炎刺激物后，巨噬细胞发生经典活化，产生大量TNF-α、IL-6、IL-1β和组织因子，从而促进局部炎症和促凝状态。最近的研究进一步表明，巨噬细胞衍生的细胞因子可以直接增强血小板反应性并放大血栓炎症反应。在支架内血栓和动脉血栓炎症的背景下，浸润的巨噬细胞会在血管损伤部位或支架支柱处积聚，持续引发慢性炎症，促进新生内膜增生并破坏血栓稳定性。因此，使用LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞的体外模型被广泛认为是评估新型化合物抗炎潜能的相关且可重复的系统，因为它能够再现巨噬细胞活化的关键方面，并允许定量评估促炎细胞因子的释放。血栓炎症网络的发现指出了超越传统抗凝的新治疗靶点——通过靶向炎症途径，可能在不增加出血风险的情况下有效抑制血栓形成。在炎症和血栓形成的相互作用网络中，环氧化酶（COX）和血小板是连接这两个系统的关键节点。COX是花生四烯酸代谢为前列腺素的关键限速酶，存在两种主要异构体：持续表达的COX-1和诱导表达的COX-2。在血栓炎症背景下，它们的作用各有侧重。COX-1在调节血小板功能中起核心作用；其代谢产物血栓烷A2是一种强效的促血小板聚集和血管收缩介质。选择性抑制COX-1是一种经典的抗血小板治疗策略。另一方面，COX-2是炎症反应的核心酶，其在LPS、细胞因子等刺激下表达上调，产生大量促炎前列腺素E2（PGE2），驱动局部和全身炎症。此外，活化的血小板不仅是血栓的“构建材料”，还是炎症反应的关键调节因子。血小板活化后，P-选择素（CD62P）迅速表达在其表面，通过与白细胞上的P-选择素糖蛋白配体-1结合介导血小板-白细胞聚集体的形成，这是直接连接炎症和血栓形成的关键事件。同时，活化的血小板还会释放各种促炎介质，如CD40配体和IL-1β，加重血管炎症。新兴的证据揭示了涉及氧化应激和特定信号通路的新血小板活化途径，这些途径可能是抗血小板治疗的潜在靶点。此外，最近的研究探讨了动脉粥样硬化相关炎症的分子机制，表明靶向特定炎症介质可以减少斑块进展和血栓并发症。随着对血栓炎症理解的深入，新型溶栓策略也在不断发展，以提高导管导向溶栓的疗效和安全性。最近的研究探索了纳米制剂溶栓剂、与抗血小板药物的联合治疗以及靶向纤溶方法，以减少纤维蛋白酶原激活剂的用量并减少出血并发症。这些策略强调了需要开发既能增强血栓溶解又能保持良好安全性的辅助药物。
希夫碱以其咪嗪基（–CN–）为特征，由于合成易行性和多样的生物活性而在药物化学中具有优势。研究表明，希夫碱及其金属配合物表现出优异的抗炎、抗氧化、抗菌甚至抗肿瘤活性。在抗炎领域，研究证实特定希夫碱类似物可作为选择性COX-1抑制剂，有效抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集。先前的报道表明，含有杂环芳烃的苯肼衍生物具有强大的抗血小板和抗炎活性，但尚未系统比较不同芳香醛基团（包括苯甲酸、酚、联苯、呋喃、噻吩和吡啶）对苯肼基希夫碱综合抗炎、抗血小板和血液相容性的影响。基于此，我们设计了十二种在苯肼核心（甲基/氯）和芳香醛（苯甲酸、酚、联苯、呋喃、噻吩、吡啶）上进行系统变化的希夫碱衍生物。这些衍生物的抗炎、抗血小板和抗血栓活性在体外进行了评估，其中的候选化合物还在模拟导管导向溶栓的溶栓协同模型中进行了测试。预计这些发现将为新型抗炎和抗血栓药物提供候选化合物。
2. 结果与讨论
2.1. 化学合成
多项先前的研究报道了希夫碱和苯肼衍生物的抗炎和抗血小板活性。例如，Lamie及其同事合成了一系列N取代的吲哚希夫碱，这些衍生物可作为双COX-2/5-LOX抑制剂，表明希夫碱骨架能有效调节花生四烯酸代谢。Khan等人的综述指出，含有呋喃、噻吩或吡啶环的杂环希夫碱通常具有更好的亲脂性和对环氧化酶酶的结合亲和力，使其成为抗炎和抗血小板药物开发的有希望的候选化合物。进一步的研究将抗血栓策略扩展到了包括免疫调节方法，这些方法可能减轻支架内再狭窄，而希夫碱衍生物的持续结构优化产生了具有双COX-2/5-LOX抑制活性的化合物。尚未对结构多样的芳香醛（包括苯甲酸、酚、联苯、呋喃、噻吩和吡啶）与苯肼核心上的甲基或氯取代基进行系统比较。基于此，我们在先前报道的方法基础上，使用乙基对甲苯甲酸和乙基对氯苯甲酸作为起始材料，通过两步反应合成了十二种希夫碱衍生物（图1）。首先，起始材料与肼水合物发生肼解反应，分别生成关键中间体4-甲基苯肼和4-氯苯肼。随后，这些中间体与六种结构多样的芳香醛（4-甲酰苯甲酸、4-羟基苯甲醛、4-联苯甲酸、呋喃-2-醛、噻吩-2-醛和吡啶-4-醛）进行希夫碱缩合反应，成功获得了十二种目标化合物，产率在81%至93%之间。所有目标化合物的结构通过质子核磁共振（1H NMR）、碳-13核磁共振（13C NMR）和高分辨率质谱（HR-MS）得到了全面确认，光谱数据与预期结构一致。在1H NMR谱中，所有化合物的肼基N–H质子在δ 11.90–11.50 ppm范围内显示单峰信号，咪嗪（–NCH–）质子在δ 8.60–8.40 ppm范围内显示特征性单峰信号。芳香质子信号分布在δ 7.98–6.60 ppm范围内，积分与每种化合物结构中的芳香质子数量相符。在13C NMR谱中，所有化合物的酰胺羰基碳在δ 165.0–163.0 ppm范围内显示信号，咪嗪碳（CN）在δ 150.0–148.0 ppm范围内显示信号，进一步确认了目标结构。化合物的纯度通过高效液相色谱（HPLC）分析，结果显示所有化合物的纯度均大于95%，符合后续生物活性测试的要求。
2.2. 化合物的细胞安全性评估
使用MTT试验评估了十二种化合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞的细胞毒性。在处理不同浓度（5、25、50、100、200 µM）的化合物24小时后，测定细胞活力。结果显示，在5–100 µM浓度范围内，所有处理组的细胞活力均高于90%，与溶剂对照组（0.1% DMSO）无显著差异。当浓度增加到200 µM时，一些化合物（）表现出轻微的细胞毒性，细胞活力降至70–85%，而其余化合物在该浓度下仍保持85%以上的细胞活力（图2A）。
2.3. 化合物的血液相容性评估
使用MTT试验评估了十二种化合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞的细胞毒性。处理24小时后，以不同浓度（5、25、50、100、200 µM）的化合物处理细胞，并测定细胞活力。结果显示，在5–100 µM浓度范围内，所有处理组的细胞活力均高于90%，与溶剂对照组（0.1% DMSO）无显著差异。当浓度增加到200 µM时，某些化合物（、、）表现出轻微的细胞毒性，细胞活力降至70–85%，而其余化合物在该浓度下的细胞活力仍保持在85%以上（图2B）。阳性对照Triton X-100（1%）引起了完全的溶血。2.3. 化合物对COX-1/COX-2的选择性抑制活性使用酶活性试剂盒测定了十二种化合物对COX-1、COX-2和5-LOX的体外抑制活性，结果总结在表1中。所有化合物对COX-1的IC50值范围为1.63至15.71 µM，对COX-2为11.38至21.36 µM，对5-LOX为10.63至26.43 µM。活性化合物对COX-1的抑制活性最强（IC50 = 1.63 µM）。同时，它对COX-2的抑制活性相对较弱（IC50 = 14.47 µM），对5-LOX的抑制活性中等（IC50 = 10.63 µM）。计算出的COX-1选择性指数（SI = COX-2 IC50/COX-1 IC50）为8.87，表明该化合物对COX-1具有高选择性，并有潜力调节花生四烯酸的双重代谢途径。考虑到这些化合物对COX-1的高选择性抑制活性及其对5-LOX的抑制效果，我们选择了最具代表性的中等选择性COX-1抑制剂，以进一步在细胞水平上验证其抗炎活性。表1. 化合物对COX-1、COX-2和5-LOX的抑制活性（IC50，µM）化合物COX-1 IC50COX-2 IC505-LOX IC50SI14.82 ± 0.3515.24 ± 1.2124.36 ± 1.181.0312.13 ± 0.1819.58 ± 0.7621.24 ± 0.951.618.47 ± 0.6221.36 ± 1.8722.65 ± 1.842.521.63 ± 0.0814.47 ± 0.9210.63 ± 0.718.871.95 ± 0.0911.38 ± 0.9811.42 ± 0.785.848.26 ± 0.2412.43 ± 1.0525.38 ± 1.261.507.23 ± 0.5618.46 ± 1.5419.27 ± 1.582.5513.84 ± 0.2913.67 ± 1.0826.43 ± 1.350.998.26 ± 0.5819.52 ± 1.6321.58 ± 1.722.3611.42 ± 0.1119.15 ± 0.7820.26 ± 0.841.6812.13 ± 0.1511.84 ± 0.9522.57 ± 1.020.9815.71 ± 0.4314.25 ± 1.1617.34 ± 1.420.91塞来昔布12.8 ± 1.020.06 ± 0.01—0.0047布洛芬13 ± 0.92370 ± 4.32—28齐留通——7.25 ± 0.61—2.4. 化合物对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的抑制作用基于酶活性筛选结果，选择了两种代表性化合物进行细胞水平的抗炎活性验证。通过LPS（1 µg/mL）刺激RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，并使用ELISA检测化合物对炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2释放的影响。结果表明（图3），与空白对照组相比，LPS刺激后模型组中的TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2水平显著升高。所有测试的化合物都以浓度依赖的方式抑制了LPS诱导的炎症因子释放。其中，目标化合物表现出更强的抑制作用：在50 µM浓度下，对IL-6、TNF-α、IL-1β和PGE2的抑制率分别为37.8%、41.8%、51.7%和54.6%。化合物也表现出良好的抗炎活性，但其抑制率低于相同浓度下的目标化合物。这些结果表明，该化合物可以在细胞水平有效抑制LPS触发的炎症级联反应，这与它的选择性COX-1抑制活性一致。
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图3. 通过ELISA评估化合物在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎活性。（A）化合物A对IL-6水平的影响。（B）化合物B对TNF-α水平的影响。（C）化合物C对IL-1β水平的影响。（D）化合物D对PGE2水平的影响。与LPS模型组相比，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；###p < 0.001 vs. 对照组。数据为三次独立实验的平均值 ± SEM。
2.5. 化合物对血小板功能和全血血栓形成的抑制作用
2.5.1. 对血小板聚集的抑制作用使用浊度法评估了优选化合物对人类血小板聚集的抑制作用，阿司匹林作为阳性对照。聚集由ADP（10 µM）、胶原蛋白（2 µg/mL）或花生四烯酸（AA，1 mM）诱导。如表2所示，化合物A对AA诱导的聚集表现出强烈的抑制作用，IC50为2.92 µM，这与它的COX-1酶抑制活性（IC50 = 1.63 µM，表1）一致。化合物B也抑制了ADP和胶原蛋白诱导的聚集，IC50值分别为5.48 µM和4.52 µM。在相同的实验条件下，阳性对照阿司匹林的IC50值分别为2.81 µM（AA）、3.51 µM（胶原蛋白）和4.49 µM（ADP）。化合物A和阿司匹林的作用强度顺序（AA > 胶原蛋白 > ADP）与其作为COX-1抑制剂的机制一致，因为AA诱导的聚集完全依赖于COX-1/TXA2途径，而胶原蛋白和ADP还涉及其他信号通路。
表2. 化合物对ADP、胶原蛋白和花生四烯酸诱导的人类血小板聚集的抑制作用（IC50，µM）
诱导剂：ADP
诱导剂：胶原蛋白
诱导剂：AA
5.48 ± 0.03
4.52 ± 0.04
2.92 ± 0.45
9.57 ± 0.04
11.66 ± 0.05
6.36 ± 0.43
阿司匹林
4.49 ± 0.04
3.51 ± 0.04
2.81 ± 0.16
值得注意的是，尽管化合物A和阿司匹林都抑制COX-1，但它们的药理机制不同。阿司匹林不可逆地乙酰化COX-1活性位点的Ser530，导致血小板寿命内的永久性酶失活。相比之下，化合物A是一种竞争性和可逆的抑制剂（第2.6节，Ki = 2.8 µM）。这种差异可能具有临床意义：可逆抑制剂可能在停药后更快恢复血小板功能，从而降低出血风险，而阿司匹林的不可逆作用提供持续的抗血小板效果但会增加出血倾向。化合物A和阿司匹林在AA诱导的聚集中的相似IC50值（2.92 µM vs 2.81 µM）反映了它们在酶水平上的相当作用强度，但化合物A的可逆性可能在辅助导管定向溶栓中提供安全优势，在出血并发症的情况下快速逆转抗血小板效果可能是可取的。
2.5.2. 对血小板活化标志物的影响使用流式细胞术检测化合物A对血小板活化标志物P-selectin（CD62P）和PAC-1结合的影响。如图4所示，在静息条件下，血小板表面的CD62P阳性率和PAC-1结合率均低于5%。ADP刺激后，模型组的CD62P阳性率增加到63.8%，PAC-1阳性率增加到60.1%，表明血小板显著活化。化合物A以浓度依赖的方式抑制了ADP诱导的CD62P表达和PAC-1结合：在50 µM浓度下，CD62P阳性率下降到32.1%（抑制率49.7%），PAC-1阳性率下降到24.8%（抑制率58.7%）。这些结果表明，化合物A不仅可以抑制血小板聚集，还可以有效抑制血小板α-颗粒释放和糖蛋白IIb/IIIa受体的活化。
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图4. 化合物A对ADP诱导的血小板活化标志物表达的影响。（A）CD62P阳性率；（B）PAC-1结合率。富血小板血浆与不同浓度的化合物A预孵育15分钟，然后加入ADP（10 µM）进行活化，检测血小板表面的CD62P和PAC-1表达。与模型组相比，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；###p < 0.001 vs. 对照组。数据为三次独立实验的平均值 ± SEM。
2.5.3. 对全血血栓形成的影响使用 thromboelastography 分析仪检测化合物A对健康人全血凝固过程的影响，结果显示在图5中。与对照组相比，化合物A以浓度依赖的方式延长了反应时间（R时间）：在25、50和100 µM浓度下，R时间分别延长至7.2、9.0和11.4分钟。同时，最大振幅（MA值）从对照组的62.3 mm逐渐下降到58.1、51.1和45.0 mm，表明血栓的最大强度减小，这与它对血小板聚集的抑制作用一致。此外，K时间随着浓度的增加而延长，α角度相应减小，进一步证实化合物A可以同时影响全血系统中的凝血因子功能和血小板功能。这些结果表明，化合物A在全血系统中具有中等的体外抗血栓作用，其中包含红细胞、白细胞和所有凝血因子。
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图5. 健康人全血与不同浓度的化合物A（25、50、100 µM）孵育，使用thromboelastography测量凝血参数。（A）反应时间（R时间）；（B）凝固时间（K时间）；（C）α角度；（D）最大振幅（MA值）。数据为三次独立实验的平均值 ± SD。与对照组相比，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
2.5.4. 平板流式室中的血栓形成实验为了评估化合物A在动脉流态下的抗血栓活性，将人全血以1000 s-1的速率流过涂有胶原蛋白的表面，有或没有化合物A（25、50、100 µM）。血栓形成通过BCA蛋白测定法量化，血小板覆盖率通过ImageJ的明场显微镜分析。如图6A和B所示，对照血液形成了蛋白质含量为45.0 µg/孔和血小板覆盖率为75.1%的稳定血栓。化合物A以浓度依赖的方式降低了这两个参数。在25 µM浓度下，血栓蛋白减少到38.3 µg（抑制率14.8%，p < 0.01），血小板覆盖率下降到58.3%。在50 µM浓度下，蛋白含量为25.3 µg（抑制率43.8%，p < 0.001），覆盖率下降到45.2%。在最高浓度（100 µM）下，血栓蛋白降至16.1 µg（抑制率64.2%，p < 0.001），覆盖率降至24.1%。这些结果表明，化合物A在含有红细胞、白细胞和所有凝血因子的全血系统中有效抑制血小板血栓形成，提供了其流动依赖性抗血栓潜力的直接体外证据。
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图6. 平板流式室中化合物A在动脉流态下的抗血栓活性。（A）通过BCA测定法测量的血栓蛋白含量。（B）通过图像分析量化的血小板覆盖率。数据为三次独立实验的平均值 ± SD。与对照组相比，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
2.5.5. 化合物A对尿激酶溶栓的协同效应及其临床意义支架内血栓形成是下肢动脉介入后的严重并发症。尽管导管定向溶栓在临床实践中被广泛使用并且有效，但它仍有局限性，如尿激酶用量大、溶栓时间长和出血风险增加。先前的实验已经证实化合物A具有良好的抗血小板聚集和血小板活化抑制活性。基于此，本研究进一步探讨了化合物A是否可以增强尿激酶的溶栓效果，为其作为导管定向溶栓辅助剂的潜力提供了实验证据。通过体外血栓溶解实验评估了化合物A和尿激酶的协同效应。将富含血小板的血浆与凝血酶和CaCl2在96孔板中孵育以形成稳定的血小板丰富血栓。称量初始血栓重量后，添加不同处理：对照组（生理盐水）、低剂量尿激酶组（100 IU/mL）、高剂量尿激酶组（500 IU/mL）、单药组（50 µM）和联合组（500 IU/mL尿激酶 + 50 µM）。在37 °C下孵育2小时后，测量剩余血栓重量以计算溶栓率；同时收集上清液检测D-二聚体水平。结果显示，单独使用尿激酶仅导致轻微的血栓溶解（溶栓率11.3%）。尿激酶以浓度依赖的方式诱导血栓溶解，低剂量组的溶栓率为35.0%，高剂量组的溶栓率为60.3%。值得注意的是，联合组（100 IU/mL尿激酶 + 化合物A）的溶栓率显著增加至45.2%。D-二聚体检测结果与溶栓率趋势一致，联合组的纤溶活性显著增强。
这些结果表明，化合物A可以显著增强尿激酶的体外溶栓效果，在降低尿激酶用量的同时保持相当的溶栓效率。这种协同效应可能源于通过以下方式抑制血小板活化：通过阻断COX-1介导的血栓素A2的生成，从而抑制血小板聚集和α-颗粒释放，导致血栓结构变得更加疏松，从而增加尿激酶的渗透性和与纤维蛋白的接触，进而提高溶栓效率。在临床背景下，支架内的血栓富含活化的血小板，使得单独使用溶栓药物难以快速穿透并溶解血栓。与抗血小板药物联合使用可能会克服这一瓶颈。因此，该化合物有可能作为导管定向溶栓的辅助药物，有望通过减少尿激酶剂量来降低出血风险，同时加速血栓溶解并缩短溶栓时间，为预防和治疗支架内血栓提供一个新的辅助治疗策略。
2.5.6. 化合物的体外ADME（吸收、分布、代谢和排泄）特性评估：使用平衡透析和人肝微粒体测定法分别评估了该化合物的血浆蛋白结合能力和代谢稳定性。在三种浓度（1、5和10 µM）下测定的血浆蛋白结合率为89.3%，且结合率与浓度无关。其在人肝微粒体中的代谢半衰期（t1/2）为0.754小时，表明其具有中等程度的代谢稳定性。这些数据表明，该化合物具有可接受的体外药物特性，游离分数约为10.7%，并对CYP450介导的降解具有中等抗性。详细结果总结在表3中。
2.5.7. 体外方法的局限性尽管该化合物在体外表现出有希望的抗血小板和抑制血栓活性以及可接受的ADME特性，但这些发现仅限于体外系统。本研究尚未评估其体内的抗血栓效果（例如，在动脉或静脉血栓模型中）、药代动力学（例如，生物利用度、血浆清除率）或出血风险。因此，在任何临床应用之前，仍需在适当的动物模型中确定其体内的转化潜力。
2.6. 化合物与COX-1的相互作用机制在固定浓度5 µM（约为IC50的3倍）下，研究了该化合物对COX-1的抑制率，并在不同浓度的花生四烯酸（1、5、20 µM）存在下的抑制率。结果显示（图8A），随着底物浓度的增加，抑制率以浓度依赖性降低：当花生四烯酸浓度为1 µM时，抑制率为85%；当浓度增加到5 µM时，抑制率降低到60%；当浓度进一步增加到20 µM时，抑制率显著降低到35%。这种现象符合竞争性抑制的典型特征——底物和抑制剂争夺同一个活性位点，底物浓度越高，抑制剂的效果越弱。该化合物对COX-1的抑制常数（Ki）计算为2.8 µM。作为比较，文献中报道的经典竞争性COX-1抑制剂布洛芬的Ki值为2.5 µM。较低的Ki值表明抑制剂与酶的结合亲和力更强。该化合物的Ki值略高于布洛芬，但仍处于1–10 µM的范围内，将其归类为具有中等亲和力的竞争性COX-1抑制剂（图8B）。该Ki值与COX-1的IC50值和抗血小板聚集活性有很好的相关性，表明其抗炎和抗血栓效果主要来自对COX-1的直接抑制。
2.7. 化合物与COX-1的分子对接该化合物与COX-1（PDB ID：1CQE）的分子对接相互作用图显示，该化合物在花生四烯酸结合口袋内稳定结合。配体与关键活性位点残基Gln44及其他残基形成氢键相互作用。此外，配体周围的PO-153相关基团表明可能存在静电互补性或溶剂介导的间接相互作用。这些相互作用力共同将化合物固定在COX-1的活性通道内，为其竞争性抑制活性提供了结构基础。
2.8. 化合物的抗氧化活性使用DPPH自由基清除试验评估了该化合物在不同浓度下的抗氧化活性，结果如图10所示。该化合物以浓度依赖性方式清除DPPH自由基。在25、50和100 µM的浓度下，其DPPH清除率分别为15.1%、27.3%和38.0%。这些结果表明，该化合物具有较弱的直接抗氧化活性，在25–100 µM的浓度范围内仅表现出中等到低的自由基清除能力。结合其强烈的COX-1抑制活性和抗血小板聚集效应，可以推断其抗炎和抗血栓效果主要来自对COX-1等目标的直接抑制，而不是通过自由基清除间接实现。这一发现与文献报道一致：Schiff碱类化合物的抗炎活性通常与其COX抑制能力直接相关，抗氧化活性并非其主要作用机制。
2.9. 结构-活性关系（SAR）分析基于体外数据的定性SAR分析揭示了以下趋势：(i) 苯肼核上的氯取代基通常比甲基类似物具有更高的COX-1抑制活性，表明吸电子基团增强了与COX-1的结合；(ii) 在六种醛类中，含有呋喃和噻吩的衍生物表现出最强的抗血小板活性，这可能是由于异原子在COX-1活性位点内的相互作用；(iii) 双苯取代的化合物具有良好的抗血小板效果，但溶血作用中等，而苯甲酸衍生物抗血小板活性最低，但血液相容性最好；(iv) 含吡啶的类似物在所有测试中表现出中等活性。基于此SAR，化合物（4-氯苯肼+呋喃-2-甲醛）被确定为兼具效果和安全性的先导化合物。
3. 结论本研究合成了十二种苯肼Schiff碱衍生物，并系统评估了它们的体外抗炎、抗血小板和抑制血栓活性。其中，化合物被鉴定为一种中等选择性的COX-1抑制剂（IC50 = 1.63 µM，SI = 8.87），同时具有对5-LOX的抑制作用。它有效抑制了促炎细胞因子的释放，抑制了ADP和胶原蛋白诱导的血小板聚集，减少了血小板活化标志物，并在动脉剪切力下减轻了血栓形成。此外，在静态体外 clot 溶解模型中，该化合物增强了低剂量尿激酶的溶栓效果。定性SAR分析表明，苯肼核上的氯取代基与含有呋喃的醛类结合，提供了最佳的活性-安全性平衡。这些体外发现表明，该化合物可能作为导管定向溶栓治疗支架内血栓的辅助药物具有潜力。需要进一步进行体内评估，以确定其抗血栓效果、药代动力学和出血风险，以确立其临床转化潜力。
4. 实验部分
4.1. 化学合成
4.1.1. 仪器和试剂所有起始材料和试剂均为商业购买的 analytical purity 纯度的产品，无需进一步纯化即可使用。反应进度通过薄层色谱（TLC）进行监测，使用硅胶板并在紫外灯（254 nm）下观察。中间体和目标化合物的熔点通过X-4微熔点仪测定。质子核磁共振（1H NMR）和碳-13核磁共振（13C NMR）谱在Bruker AV-400 NMR光谱仪上记录，以四甲基硅烷（TMS）为内标，DMSO-d6为溶剂。高分辨率质谱（HR-MS）使用Agilent 6520 Q-TOF质谱仪进行。化合物纯度使用Agilent 1260高效液相色谱系统进行检测，配备C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）。
4.1.2. 目标化合物的合成将乙基对甲基苯甲酸酯（10 mmol）和乙基对氯苯甲酸酯（10 mmol）分别溶解在无水乙醇（30 mL）中，然后加入80%肼水合物（20 mmol）。混合物在回流条件下加热6–8小时。通过TLC监测反应完成后，冷却至室温，析出白色固体。通过吸滤收集固体，并从乙醇中重结晶得到中间体4-甲基苯肼和4-氯苯肼。上述中间体（1 mmol）溶解在无水乙醇（15 mL）中，分别加入等摩尔量的芳香醛（4-甲酰苯甲酸、4-羟基苯醛、4-联苯甲醛、呋喃-2-甲醛或吡啶-4-甲醛）。混合物在回流条件下加热4–6小时。通过TLC监测反应完成后，冷却并析出固体，通过吸滤收集固体，用乙醇洗涤并干燥，得到目标化合物，产率在81%到93%之间。所有目标化合物通过1H NMR、13C NMR和HR-MS表征其结构。
4.1.3. 4-((2-(4-氯苯甲酰)肼基)甲基)苯甲酸（）产率为83%，白色固体粉末，熔点286–289 °C。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 12.08 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.01 (m, 4H), 7.87 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 8.1 Hz, 2H)。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ 166.68, 162.02, 146.71, 138.05, 136.54, 129.58, 129.41, 128.40, 126.93, 39.52。TOF-MS，m/z: [M + H]+，C15H12ClN2O3+ 的计算值为303.0536，实测值为303.05。
4.1.3.1. 4-氯-N′-(4-羟基苯基甲基)苯肼（）产率为83%，白色固体粉末，熔点204–206 °C。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 11.74 (s, 1H), 9.97 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.60 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 2H)。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ 161.83, 159.53, 148.51, 136.41, 132.36, 129.48, 128.94, 128.53, 125.22, 115.75。TOF-MS，m/z: [M + H]+，C14H12ClN2O2+ 的计算值为275.0587，实测值为275.05。
4.1.4. N′-([1,1′-联苯]-4-基甲基)-4-氯苯肼（）产率为88%，熔点187–189 °C。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 11.98 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.90–7.71 (m, 5H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.42 (s, 1H)。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ 162.05, 147.68, 141.64, 139.30, 136.59, 133.33, 132.12, 129.55, 129.01, 128.57, 127.05, 126.66, 39.52。TOF-MS，m/z: [M + H]+，C20H16ClN2O+ 的计算值为335.094，实测值为335.09。
4.1.5. 4-氯-N′-(呋喃-2-基甲基)苯肼（）产率为85%，白色固体粉末，熔点239–241 °C。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 11.88 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.95 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.86 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.45 (s, 1H)。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ 162.23, 149.58, 145.47, 138.09, 136.82, 132.25, 129.71, 128.78, 113.91, 112.42, 39.52。TOF-MS，m/z: [M + H]+，C12H10ClN2O+ 的计算值为249.043。
4.1.6. 4-氯-N′-(噻吩-2-基甲基)苯肼（）产率为87%，白色固体粉末，熔点197–199 °C。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 11.86 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.65 (s, 1H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.45 (s, 1H)。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ 162.16, 143.47, 139.22, 136.80, 132.29, 131.28, 129.70, 129.27, 128.77, 128.06, 39.52。TOF-MS，m/z: [M + H]+，C12H10ClN2OS+ 的计算值为265.020。
4.1.7. 4-氯-N′-(吡啶-4-基甲基)苯肼（）产率为89%，白色固体粉末，熔点201–203 °C。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 12.16 (s, 1H), 8.62 (s, 2H), 8.41 (s, 1H), 7.93 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.73–7.44 (m, 4H)。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ 162.67, 151.31, 150.49, 145.94, 141.64, 137.18, 129.91, 128.88, 121.28。TOF-MS，m/z: [M + H]+，C13H11ClN3O+ 的计算值为260.059。
4.1.8. 4-((2-(4-甲基苯甲酰)肼基)甲基)苯甲酸（）产率为90%，白色固体粉末，熔点260–262 °C。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 11.91 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.99 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.81 (s, 3H), 7.31 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H)。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ 167.10, 163.32, 146.70, 142.16, 138.65, 131.87, 129.98, 129.21, 127.90, 127.23, 39.52。**TOF-MS分析**
米氏质量数（m/z）：[M + H]+，C16H15N2O3+ 的理论值为 283.1082，实测值为 283.1084。
**4.1.1 N'--(4-羟基苯亚甲基)-4-甲基苯肼**
质量：224 mg，产率为 88%。白色固体粉末。熔点（M.P.）为 197 – 199 °C。
1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 11.56 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.80 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.28 (s, 2H), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H)。
13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）：δ 159.57, 148.10, 141.73, 130.97, 129.12, 127.73, 115.90, 39.52, 21.19。
**4.1.2 N'-([1,1'-联苯]-4-基亚甲基)-4-甲基苯肼**
质量：292 mg，产率为 93%。白色固体粉末。熔点（M.P.）为 186 – 189 °C。
1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 11.83 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.90–7.65 (m, 4H), 7.48 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H)。
13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）：δ 163.22, 146.37, 142.05, 134.62, 133.55, 130.64, 129.17, 128.83, 127.84, 39.52。
**4.1.3 N'--(呋喃-2-基亚甲基)-4-甲基苯肼**
质量：196 mg，产率为 86%。白色固体粉末。熔点（M.P.）为 210 – 212 °C。
1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 11.71 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.92–7.71 (m, 3H), 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.90 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 2.34 (s, 3H）。
13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）：δ 163.11, 149.73, 145.27, 142.00, 137.54, 130.67, 129.18, 127.78, 113.45, 112.36。
**4.1.4 4-甲基-N'--(噻吩-2-基亚甲基)苯肼**
质量：212 mg，产率为 87%。白色固体粉末。熔点（M.P.）为 185 – 188 °C。
1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 11.74 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 7.80 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.64 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.12 (s, 1H), 2.34 (s, 3H）。
13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）：δ 162.89, 142.71, 139.22, 130.74, 128.98, 127.82, 127.58。
**4.1.5 4-甲基-N'--(吡啶-4-基亚甲基)苯肼**
质量：215 mg，产率为 90%。白色固体粉末。熔点（M.P.）为 193 – 196 °C。
1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ 12.03 (s, 1H), 8.62 (s, 2H), 8.43 (s, 1H), 7.83 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.63 (s, 2H), 7.31 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H)。
13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）：δ 150.45, 145.26, 129.25, 127.98, 121.16。
**4.2 细胞安全性评估**
**4.2.1 细胞毒性检测（MTT法）**
从中国科学院细胞库购买小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，并在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中培养，培养条件为37 °C、5% CO2。将对数生长期的RAW264.7细胞以每孔1 × 10^4细胞的密度接种到96孔板中。培养24小时后，加入不同浓度（5, 25, 50, 100, 200 µM）的测试化合物，每个浓度设置三个重复孔。同时设有溶剂对照组（0.1% DMSO）和空白对照组。继续培养24小时后再加入20 µL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4小时。測量上清液的吸光度（OD值）。细胞活力（%）= (实验组OD - 空白组OD) / (对照组OD - 空白组OD) × 100%。
**4.2.2 红细胞溶血试验**
商业购买新鲜抗凝人血（Merck），通过离心分离红细胞，并用生理盐水洗涤三次，制备成2%的红细胞悬浮液。将不同浓度（25, 50, 100 µM）的测试化合物与等体积的红细胞悬浮液混合，37 °C下孵育1小时。离心后收集上清液，并在540 nm处测量吸光度。以0.1% DMSO溶液作为阴性对照，1% Triton X-100作为阳性对照。溶血率（%）= (样品OD - 阴性对照OD) / (阳性对照OD - 空白对照OD) × 100%。
**4.3 COX-1/COX-2/5-LOX抑制活性测定**
使用相应的酶活性试剂盒（购自Beyotime Biotechnology Co., Ltd.）测定化合物对COX-1、COX-2和5-LOX的抑制活性。按照试剂盒说明书进行实验，分别设置空白对照组、阳性对照组（COX-2用celecoxib，5-LOX用zileuton）和不同浓度的测试化合物组。计算每种化合物对三种酶的半数抑制浓度（IC50），并确定COX-1选择性指数（SI = COX-2 IC50 / COX-1 IC50）。
**4.4 抗炎活性评估**
将对数生长期的RAW264.7细胞以每孔2 × 10^5细胞的密度接种到24孔板中。培养24小时后，加入不同浓度（25, 50, 100 µM）的化合物进行预处理1小时，随后用LPS（最终浓度1 µg/mL）刺激24小时。设置空白对照组（无LPS刺激）和模型对照组（仅LPS刺激）。收集细胞培养上清液，使用ELISA试剂盒（购自R&D Systems Biotechnology Co., Ltd.）测定上清液中的TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2水平。
**4.5 血小板功能评估**
**4.5.1 血小板聚集试验**
商业购买新鲜人全血（Keyuan Xin Biotechnology Co., Ltd.）。通过200 × g离心10分钟制备富血小板血浆（PRP），通过2000 × g离心10分钟制备贫血小板血浆（PPP）。使用血小板聚集仪通过浊度法测量血小板聚集率。将PRP与不同浓度的化合物预孵育15分钟，然后加入ADP（最终浓度10 µM）或胶原（最终浓度2 µg/mL）诱导血小板聚集。连续记录5分钟的聚集情况，PPP作为空白对照。计算抑制率并确定IC50值。对于花生四烯酸（AA）诱导的聚集，将AA（最终浓度1 mM，Sigma-Aldrich）在预孵育后加入PRP中。
**4.5.2 血小板活化标志物检测**
将PRP与不同浓度的化合物预孵育15分钟，然后用ADP（10 µM）或胶原（最终浓度2 µg/mL）活化10分钟。分别加入FITC标记的抗人类CD62P抗体和PAC-1抗体，在黑暗中孵育20分钟。稀释后使用流式细胞仪分析样本。每个样本收集10,000个血小板，计算CD62P阳性和PAC-1结合率。
**4.6 全血血栓形成试验**
商业购买新鲜人全血（Keyuan Xin Biotechnology Co., Ltd.）。将不同浓度的化合物（25, 50, 100 µM）加入1 mL全血样本中并充分混合。随后将340 µL混合物转移到血栓弹性测定仪的测试杯中，根据仪器操作规程测量反应时间（R时间）、凝血时间（K时间）、α角度和最大幅度（MA值）。对照组加入等体积的生理盐水。
**4.7 体外溶栓协同实验**
将PRP与凝血酶（最终浓度10 U/mL）和CaCl2（最终浓度20 mM）混合，立即充分混合后加入96孔板中，37 °C下孵育2小时形成稳定的富血小板血栓。记录每个孔中血栓的初始重量。血栓随机分为六组：对照组（生理盐水）、低剂量尿激酶组（100 IU/mL）、高剂量尿激酶组（500 IU/mL）、单药组（50 µM尿激酶）和高剂量组合组（500 IU/mL尿激酶+50 µM）。向每个孔中加入相应试剂（100 µL），37 °C下孵育2小时。孵育后弃去上清液，并测量溶栓率（% = （初始重量 - 剩余重量）/ 初始重量 × 100%）。
**4.8 COX-1抑制机制研究**
在固定浓度（5 µM）的化合物存在下，使用COX-1活性试剂盒测量酶活性，并在不同浓度的花生四烯酸（1, 5, 20 µM）条件下进行比较，计算抑制率。设立一系列不同浓度的花生四烯酸（1, 2, 5, 20 µM）和化合物（0, 0.5, 1, 2, 4 µM）以测定COX-1酶活性。使用Dixon图分析和非线性回归拟合计算Ki值。
**4.9 抗氧化活性评估（DPPH清除试验）**
将化合物溶解于无水乙醇中制备不同浓度（25, 50, 100 µM）。取100 µL样品溶液与100 µL DPPH乙醇溶液（0.1 mM）混合，在室温下避光孵育30分钟。以维生素C（100 µM）作为阳性对照。DPPH清除率（%）= (A_blank - A_sample) / A_blank × 100%。
**4.10 平板流动室试验**
玻璃盖片在4 °C下用200 µg/mL的I型胶原蛋白 coated overnight，然后用1% BSA封闭1小时。将盖片组装成平板流动室。用人血（柠檬酸化）并以10 mM CaCl2再钙化，与化合物（25–100 µM）或0.1% DMSO预孵育5分钟，以1000 s−1的剪切率通过流动室。用PBS冲洗后，通过BCA测定法测量血栓形成情况，并通过ImageJ分析血小板覆盖率。
**4.11 血浆蛋白结合试验**
将化合物加入人血浆中，分别在1, 5和10 µM浓度下进行处理。使用96孔RED装置在37 °C下用PBS透析6小时。透析后，将样本与含有内标物的乙腈混合并离心，通过LC-MS/MS分析。计算PPB（%）= (C血浆 - Cbuffer) / C血浆 × 100%。每个浓度重复三次。
**4.12 代谢稳定性试验**
将化合物（1 µM）与人肝微粒体（0.5 mg/mL）和1 mM NADPH一起在37 °C下孵育。在0, 5, 15, 30, 45和60分钟时分别取样，并用含内标物的冰冻乙腈终止反应。离心后，通过LC-MS/MS分析上清液。根据ln(剩余部分) vs. 时间的图计算半衰期（t1/2）。
**4.13 分子对接分析**
从RCSB蛋白质数据库（PDB ID: 1CQE）获取COX-1的三维结构。使用分子对接软件进行蛋白质 preparations，包括去除水分子和原始配体、添加极性氢原子及分配部分电荷。使用分子建模工具构建化合物的三维结构，并能量最小化。采用半柔性对接方法进行对接，网格框覆盖花生四烯酸结合口袋。选择结合能量最低的构象进行相互作用分析。通过将共结晶配体重新对接到结合位点来验证对接方案。
**4.14 统计分析**
所有实验数据以平均值 ± 标准差（mean ± SD）表示。使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Dunnett's检验，两组间比较采用Student's t检验。p < 0.05视为统计学显著。
**利益冲突**
作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。
