浸润性小叶癌（ILC）约占乳腺癌的10–15%。尽管ILC对抗雌激素治疗反应良好，但癌细胞播散和治疗耐药仍是患者面临的重大风险。ILC晚期复发较为常见，提示播散肿瘤细胞（DTC）休眠可能是其转变为转移性病变之前的机制。研究人员通过多维度微区室化体外模型，研究了抗雌激素耐药与休眠之间的关系。该生物工程平台再现了ILC的形态学特征，并突出了其与浸润性导管癌（IDC）的区别。诱导可逆休眠表型揭示了抗雌激素耐药ILC细胞的表观遗传变化，以及其对底物表面的化学和机械感知增强，其中p27Kip1信号发挥核心作用。研究人员提出该平台可作为研究ILC休眠及其表现的高通量方法，采用简化且快速的方式。
乳腺癌局部病变的5年生存率超过95%，但一旦发生远处转移，5年生存率降至约33%，提示播散肿瘤细胞（DTC）在肿瘤复发中的关键作用。晚期复发在激素受体（HR）阳性乳腺癌中尤为常见。ILC和IDC是HR阳性乳腺癌最常见的两种组织学亚型，但ILC研究明显不足，临床治疗多基于IDC研究证据。ILC患者长期无病生存率和总生存率较低，循环肿瘤细胞（CTC）或DTC数量较IDC患者更多，提示休眠DTC可能驱动ILC晚期复发，但相关研究极少。ILC细胞增殖指数低，成功建立的细胞系、患者来源异种移植模型及小鼠模型数量有限，且小鼠模型表现出转移征象需6个月以上。因此，开发具有生理学相关性、可调控且区别于IDC模型的ILC休眠模型成为亟待解决的科学问题。
在美国食品药品监督管理局（FDA）现代化法案2.0和3.0推动下，临床试验前提不再 solely 依赖动物模型，这促进了利用人源细胞进行临床前测试的生物工程检测方法的发展。微区室化细胞培养具有多项优势，包括多细胞亚群均匀性、批次间可重复性、技术重复间均一条件、操作简便、高通量成像与分析、快速质量控制以及实验设计的精确控制，因此成为全面研究ILC休眠的有效候选方案。
研究人员采用涵盖二维（2D）、伪三维（pseudo-3D）和三维（3D）培养的三种微区室化技术，系统探究了细胞-蛋白、细胞-细胞和细胞-基质相互作用。第一种技术为光诱导分子吸附（LIMA），通过在刚性底物上形成聚-L-赖氨酸-接枝-甲氧基聚乙二醇（PLL-g-mPEG）聚合物刷，利用数字微镜器件（DMD）投影紫外光降解特定区域mPEG链，实现细胞外基质（ECM）蛋白的选择性吸附和细胞黏附，从而研究细胞-蛋白相互作用。第二种技术为原位光聚合微腔，通过DMD将灰度抛物面阵列转换为紫外投影，利用氧气对4臂聚乙二醇丙烯酸酯（4-arm PEGA）自由基聚合的抑制作用，实现快速 topoographical 控制，形成非黏附性PEG微腔，促进细胞在重力作用下聚集形成多细胞阵列，研究细胞-细胞相互作用。第三种技术为微流控微凝胶生成，将琼脂糖基细胞悬液分散于含氟表面活性剂的连续相中，通过降低温度交联微液滴，再用全氟辛醇（PFO）破乳完成向培养基的转换，实现3D培养中的细胞-基质相互作用。
研究人员首先利用上述技术再现了ILC与IDC的形态学差异。将代表ILC的MDA-MB-134 VI（MB134）细胞、代表IDC的MCF7细胞和代表三阴性乳腺癌（TNBC）的MDA-MB-231细胞接种于纤维连接蛋白1（FN1）微图案上，发现MCF7细胞48小时内填满微图案，而MB134细胞增殖缓慢、保持静止；MCF7细胞形成球形结构后扩展为单层并排出单个细胞，而MDA-MB-231细胞则展现手性运动。为模拟治疗后持续存在的ILC细胞，研究人员建立了对他莫昔芬耐药的MB134-T和SUM44-T细胞系，其半数抑制浓度（IC
50）值分别提高至16.38 ± 0.11 µM和27.30 ± 1.02 µM。形态学分析显示，MB134-T细胞在FN1微图案上铺展类似MCF7细胞，而MB134-P细胞保持独特表型；通过k-均值聚类和线性判别分析（LDA），MB134-T细胞与MCF7细胞更为相似。E-cadherin（由CDH1编码）免疫荧光验证显示仅MCF7细胞表达该蛋白。长期培养后，MCF7细胞沿z轴形成3D结构且E-cadherin富集于细胞-细胞连接处，MB134-P细胞保持单排排列（与体内观察一致），MB134-T细胞形成2-3个细胞高度的小3D结构。微腔实验中，MCF7细胞快速自组织为紧凑球体，MB134细胞形成松散、无凝聚力的结构，微凝胶中MB134细胞主要形成葡萄样聚集体——这与ILC小鼠导管内模型观察到的结构相似。
基于MB134-P和MB134-T细胞与微图案表面相互作用的差异，研究人员进一步探究了化学信号对休眠的影响。FN1促进增殖，而III型胶原α1链（COL3A1）与单细胞休眠反应相关且在ILC细胞中上调。有趣的是，MB134-P细胞优先黏附于COL3A1，而MB134-T细胞优先黏附于FN1。通过血清和氧气剥夺联合处理48小时诱导休眠，流式细胞术显示MB134-T细胞在剥夺条件下G
0/G
1期细胞显著聚集，S期和G
2/M期减少；而MB134-P细胞对剥夺条件无反应。利用PIP-FUCCI生物传感器进行单细胞周期动态实时追踪，证实MB134-T细胞在两种微区室化平台上均表现出G
0/G
1期增强积累。
为验证G
0/G
1期停滞与休眠的关联，研究人员筛选了多种标志物。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂p27
Kip1在剥夺条件下于MB134-P和MB134-T细胞中均显著增加，且在MB134-T细胞中COL3A1微图案上表达几乎增加两倍，而增殖标志物Ki-67变化趋势不一致。DTC休眠标志物核受体亚家族2组F成员1（NR2F1）和组蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）在MB134-T细胞中亦呈微图案蛋白依赖性上调。细胞核大小分析显示p27
Kip1阳性细胞核较小，符合静息特征；恢复控制条件后细胞继续生长，证实休眠表型的可逆性。磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（p-Rb）分析揭示MB134-T细胞在剥夺条件下呈现低或中等水平的p-Rb，表明其对进入S期承诺较低，特别是p27
Kip1阳性细胞。
研究人员观察到四种ILC细胞系中p27
Kip1表达存在差异，进而探究了分子机制。既往研究表明hsa-miR-221-3p和hsa-miR-222-3p与他莫昔芬耐药相关。筛查发现这两种微小RNA（miRNA）在MB134-T细胞中较MB134-P细胞上调，但在SUM44细胞中未观察到。重要的是，hsa-miR-221-3p和hsa-miR-222-3p是p27
Kip1的已知转录后抑制因子，可结合其3'非翻译区（3'-UTR）。剥夺条件下这两种miRNA下调超过五倍，且其固有表达水平与剥夺后p27
Kip1表达呈对数相关性。这提示MB134-T细胞通过miRNA下调和NR2F1介导的染色质抑制发生表观遗传修饰，诱导p27
Kip1介导的休眠。
休眠DTC获得间充质样表型并表现细胞伸长。剥夺条件下MB134-T细胞呈现更圆形态，而全内反射荧光显微镜（TIRFM）和扫描电子显微镜（SEM）证实F-actin富集的丝状伪足形成。长宽比（AR）量化显示剥夺条件下细胞伸长增加。转录因子SOX9（维持祖细胞池的关键因子，在易休眠的CTC和DTC中表达）从细胞质向核内转位，与p27
Kip1有适度共定位。
为消除细胞-蛋白相互作用，研究人员采用物理抑制（微腔）和药理学抑制（FAK/Pyk2抑制剂PND-1186）两种方法。微腔中YAP主要位于细胞质，MB134-T细胞Ki-67表达显著降低而p27
Kip1上调；PND-1186处理 similarly 降低Ki-67并略微增加p27
Kip1。这表明MB134-T细胞与底物表面的相互作用是ILC休眠的关键决定因素，去除该相互作用可导致更深的休眠状态。
转录组学分析显示MB134-P和MB134-T细胞在FN1微图案、COL3A1微图案和微腔中存在显著差异，微腔剥夺条件下差异最为显著。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析揭示微腔剥夺条件下MB134-T细胞中上调的通路包括癌症中的miRNA、多梳抑制复合体和内质网蛋白质加工。与p27
Kip1趋势正相关的13个转录本涉及细胞周期停滞（UBXN2A、MXD4、USP42）、内质网应激反应（ERN1）、雌激素受体α抑制（ZNF496）、肌动蛋白细胞骨架功能与机械感知（TPM2）、早期播散（LTBP3）、他莫昔芬耐药（MUC1）和细胞周期退出（SAV1）。
研究结论：本研究通过多种维度的生物工程方法设计了首个ILC休眠平台，包含2D、伪3D和3D培养。该微区室化平台克服了传统方法的局限性，实现了小型化、可控化和一致性。研究证实ILC休眠是以p27
Kip1信号为核心的多面现象，抗雌激素耐药相关的hsa-miR-221-3p和hsa-miR-222-3p下调可释放p27
Kip1翻译抑制，促进休眠；MB134-T细胞对化学和机械刺激敏感，YAP核定位与p27
Kip1表达负相关。该平台可作为高通量方法用于研究ILC休眠及其表现，为加速ILC休眠新型治疗方法的开发提供支持。未来研究将利用该系统评估减少p27
Kip1信号扰动的潜在治疗候选物，包括miRNA antagomirs和agomirs、化学抑制剂、药物组合，以及靶向RNA测序数据中发现的新的基因和通路。该研究发表在《Advanced Healthcare Materials》。
