靶向患者来源新抗原的肿瘤疫苗为个性化肿瘤治疗提供了广阔前景，但仍面临如何实现向抗原呈递细胞（APCs)靶向递送以诱导 robust 且持久的肿瘤特异性免疫应答的挑战。为此，研究人员开发了一种抗小鼠CD40激动性-单价链霉亲和素融合抗体（αCD40-mSAs），其靶向APCs表面的关键刺激性受体CD40，以将生物素化新抗原肽直接递送至引流淋巴结（dLNs）中的APCs。研究人员确认工程化抗体表达了mSA，且其对鼠源CD40和生物素具有强亲和力。先进显微镜技术证明αCD40-mSAs可增强向dLNs的归巢以及新抗原肽向关键APC亚群（如常规1型树突状细胞，cDC1s)的胞内递送。αCD40-mSAs与新抗原肽的有效胞内共递送主要驱动了树突状细胞（DCs)激活和抗原呈递的增强。体内疫苗接种实验表明，负载肽的αCD40-mSAs可诱导 robust 的肿瘤特异性CD8+ T细胞应答，在小鼠肿瘤模型中导致显著的肿瘤消退和预防效果。这些结果支持αCD40-mSAs作为一种多功能疫苗递送平台，通过将靶向递送和免疫刺激整合于单一工程化抗体系统中，具有免疫药理学优势。该研究解决了当前肿瘤疫苗策略的主要局限，为个性化肿瘤免疫治疗提供了一个具有强转化潜力的模块化平台。
癌症疫苗靶向来源于个体患者突变组学的新抗原，是极具前景的个性化肿瘤免疫治疗策略。与靶向过表达或肿瘤相关抗原的疫苗不同，新抗原不受中枢或外周免疫耐受的影响，因此是诱导肿瘤特异性免疫应答、同时将自身免疫等不良反应风险降至最低的理想靶点。肽类和mRNA合成技术的最新进展使其被广泛用作肿瘤疫苗的抗原材料，具有快速定制和成本效益高的特点，利于临床应用。然而，裸mRNA由于稳定性差和生物安全性问题不适合直接给药，需要包裹于脂质体等纳米颗粒载体中，这在配制个性化疫苗时带来了监管和生产挑战。相比之下，合成长肽（SLPs）具有更高的体内稳定性，可直接与佐剂简单混合后给药，更适合用于临床试验中的个性化肿瘤疫苗。多项采用新抗原肽的临床研究已显示出一定的临床获益，包括抗肿瘤免疫应答和长期预防肿瘤复发。然而，仅部分患者能从这类疫苗中获益，因为大多数情况下无法建立 robust 且持久的肿瘤特异性CD8
+ T细胞免疫，而这对于有效的抗肿瘤疫苗效果至关重要。
未配制的肽和佐剂经皮下或肌肉注射后，依赖于局部皮肤和表皮抗原呈递细胞（APCs）的被动摄取，这些APCs随后迁移至引流淋巴结（dLNs)以启动T细胞活化。但这种非特异性的被动递送途径常导致细胞摄取效率低、dLNs转运有限、抗原呈递欠佳以及免疫激活不一致，从而降低疫苗效力并增加脱靶免疫应答的风险。为克服这些局限，研究人员积极探索向dLNs中APCs靶向递送疫苗的策略。值得注意，低分子量生物分子如肽（<40 kDa）皮下注射后主要进入血液，而较大分子如IgG抗体（>84 kDa）则优先引流入淋巴系统。此外，肽与佐剂的简单混合物常因其生物物理学特性和药代动力学差异而独立转运，阻碍其共递送至同一APCs，限制有效的APC激活和抗原呈递。
为解决这一挑战，多种纳米颗粒制剂被开发用于肽和佐剂的共递送。然而，这类平台在患者定制疫苗生产方面面临转化障碍。基于抗体的肽疫苗策略也已被探索，例如靶向DCs的抗DEC-205和CLEC9A抗体，通过肽-抗体重组表达肿瘤相关抗原（如NY-ESO-1）。但这些方法涉及复杂的合成，且需要额外佐剂，不利于快速可定制生产。因此，仍需一种多功能疫苗递送平台，能够实现：（1）靶向dLNs中的APCs（如DCs），（2）实现APCs的高效细胞内化，（3）在单一制剂中共递送抗原和佐剂。此类平台还需保持灵活性以适应多样化新抗原肽，从而实现个性化肿瘤疫苗的临床转化。
CD40是肿瘤坏死因子受体超家族成员，表达于dLNs中DCs和巨噬细胞等多种APCs的质膜上。作为参与先天性和适应性免疫应答的关键共刺激分子，使用抗CD40激动性抗体（αCD40）激活CD40可促进DCs成熟和dLNs中T细胞活化，从而产生 robust 的抗肿瘤免疫。此外，与膜表达CD40结合的αCD40可被有效内化进入DCs的早期内体。IgG抗体（包括αCD40）具有天然的dLN归巢特性，皮下注射后可快速淋巴引流，进一步支持将αCD40用作dLN归巢型疫苗载体。
本研究中，研究人员充分利用αCD40的免疫药理学优势，包括其dLN归巢、APC靶向、细胞内化和免疫刺激能力，将其作为肿瘤新抗原肽的递送载体。为实现灵活的肽偶联，研究人员将αCD40工程化以在两条轻链的C末端表达单价链霉亲和素（αCD40-mSAs）。该构建体可通过mSA-生物素相互作用实现生物素化新抗原肽的稳定高亲和力结合。先进的生物素化技术可实现位点特异性标记，且不改变序列或生物物理学特性。因此，αCD40-mSAs代表了个性化肿瘤疫苗的模块化递送系统。研究证实，αCD40-mSAs可增强新抗原肽向dLNs中APCs的递送，促进肿瘤特异性T细胞应答的诱导，在小鼠肿瘤模型中产生治疗和预防性抗肿瘤效果。这些发现支持αCD40-mSAs作为一种有前景的新抗原肽递送平台，用于个性化肿瘤疫苗治疗。
研究人员采用的关键技术方法包括：在ExpiCHO-S细胞表达系统中重组表达αCD40-mSAs抗体，通过Protein A亲和层析纯化；利用SDS-PAGE、质谱光度法（MP）进行分子量表征；采用表面等离子体共振（SPR）技术测定与鼠源CD40的亲和力；运用荧光偏振（FP）法评估与生物素的结合；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）验证功能活性；利用活体成像系统（IVIS）进行体内生物分布分析；借助共聚焦显微镜和DeepSIM超分辨率显微镜进行细胞内定位观察；运用流式细胞术进行细胞表型分析和抗原特异性T细胞检测；采用RNA测序结合基因集富集分析（GSEA）解析免疫激活机制；使用C57BL/6小鼠建立MC38结直肠癌和B16F10黑色素瘤同源肿瘤模型进行疫苗效力评估；并通过血液学检测和临床化学分析进行毒理学评价。
**合成与表征CD40激动性-单价链霉亲和素融合抗体（αCD40-mSAs）**
研究人员设计了在轻链C末端通过短肽间隔区融合单价链霉亲和素（mSA）的抗CD40激动性抗体（αCD40-mSAs）。采用抗小鼠CD40激动性抗体（克隆FGK4.5）的互补决定区（CDRs）序列和mSA序列，基于鼠IgG2a（具与人IgG1相似的Fcγ受体结合特性）重建克隆载体。通过CHO细胞表达系统生产，Protein A纯化后获得高产量的重组抗体。SDS-PAGE显示，还原条件下αCD40-mSAs轻链因mSA糖基化而呈单一条带（~50 kDa），非还原条件下分子量约200 kDa；去糖基化后轻链从~25 kDa增至~40 kDa，证实mSA成功表达。质谱光度法测得αCD40和αCD40-mSAs的峰值分子量分别为~155 kDa和~194 kDa。SPR分析显示，αCD40-mSAs与鼠源CD40的平衡解离常数（Kd = 12.7 nM）与亲本αCD40（12.3 nM）及商业抗体（8.4 nM）相当。FP测定αCD40-mSAs与生物素的Kd为69.23 nM，ELISA进一步验证了其生物素结合功能。
**生物素化肽负载αCD40-mSAs诱导体内抗原特异性CD8+ T细胞应答**
为评估αCD40-mSAs诱导抗原特异性CD8
+ T细胞应答的能力，研究人员采用含OVA
257–264表位（SIINFEKL）的生物素化SLP（Bio-OVA）进行免疫。单剂疫苗接种后，αCD40-mSAs-Bio-OVA组小鼠淋巴结和脾脏中OVA四聚体
+ CD44
+ CD8
+ T细胞的比例和绝对数量均显著高于其他疫苗组，表明αCD40-mSAs疫苗接种可诱导 robust 的新抗原特异性CD8
+ T细胞免疫。
**αCD40-mSAs的淋巴结归巢与APC靶向新抗原肽递送**
通过足垫注射后的活体成像，研究人员证实αCD40-mSAs-Bio-OVA在注射后1.5小时即显著富集于腘窝引流淋巴结（dLNs），且信号强度高于24小时时间点，显示快速的归巢能力。主要器官中仅肾脏有短暂信号，生物流体分析显示尿液中肽相关信号高但24小时基本清除，血浆中Bio-OVA水平始终较低（<0.4 nM），表明非靶向成分经肾途径快速清除、系统暴露极小。
共聚焦显微镜显示，αCD40-mSAs-Bio-OVA组dLNs中Bio-OVA荧光信号强度较单独肽或混合物组提高1.54倍，且与αCD40-mSAs空间重叠。高分辨率成像证实Bio-OVA与αCD40-mSAs在CD11c
+ DCs和CD169
+窦相关巨噬细胞（SCS macrophages）中共定位。流式细胞术显示，OVA
+细胞中约70%为CD169
+窦相关巨噬细胞，约50%为CD11c
+ DCs；且超过半数的OVA
+ CD11c
+ DCs表达cDC1标志物CD103和XCR1。体外超分辨率显微镜和流式分析进一步验证，αCD40-mSAs递送后BMDCs中OVA
+ CD11c
+比例>40%，BMDMs中>80%，显著高于其他组别。
**αCD40-mSAs介导的抗原肽共递送增强抗原呈递与DC激活**
αCD40-mSAs单独处理BMDCs 24小时后，表面激活标志物CD40和CD80表达显著升高，IL-12p40分泌增加，且与亲本αCD40无显著差异，表明mSA组分不额外赋予显著免疫刺激效应。然而，当与Bio-OVA偶联后，αCD40-mSAs-Bio-OVA组的IL-12分泌显著高于αCD40与Bio-OVA混合物组，抗原呈递比例达~25%（混合物~20%，单独肽~12%）。CD40受体阻断实验证实，预先用游离αCD40占据表面CD40后，αCD40-mSAs-Bio-OVA诱导的SIINFEKL/H-2K
b呈递显著降低，证明该效应依赖于CD40介导的靶向内化而非非特异性被动摄取。
**批量RNA测序揭示αCD40与αCD40-mSAs处理后BMDCs的动态免疫激活**
对αCD40和αCD40-mSAs处理6小时的BMDCs进行批量RNA测序，GSEA分析显示两组均调节免疫应答通路：TNFα通过NF-κB信号、炎症应答和干扰素-γ应答通路呈负富集（NES<0），与CD40信号快速动力学一致；IL-2/STAT5信号通路呈正富集（NES>0），提示向后期免疫激活状态转化。基因水平分析发现，αCD40-mSAs优先诱导DC成熟和抗原呈递相关基因（Il12b、Cd86、B2m）及Th1相关T细胞趋化程序（Cxcl11、Cxcl9），而αCD40则诱导更广泛的炎症激活谱。表明αCD40-mSAs虽保留核心CD40信号通路，但倾向于功能DC成熟和T细胞支持性免疫状态的转录程序。
**αCD40-mSAs治疗性疫苗对已建立肿瘤的效力**
在MC38结直肠癌模型中，肿瘤体积达100 mm
3后开始疫苗接种（prime-boost-boost），αCD40-mSAs-Bio-MC38组（G4）显著抑制肿瘤生长，10只小鼠中3只完全消退，平均肿瘤体积显著小于其他组（p<0.0001）；中位生存期显著延长（log-rank p<0.0001）。在更具侵袭性的B16F10黑色素瘤模型中，G4组同样显示更优的肿瘤控制效果，中位生存期达25天（对照18天、单独肽20天、混合物18.5天，p<0.0001）。
**αCD40-mSAs疫苗对肿瘤发展的预防性效果**
预防性接种（prime-boost-boost）后两周接种MC38细胞，G4组显示肿瘤发生延迟、生长显著受抑（与对照比p=0.0136），且生存期显著延长（中位28天 vs 对照19天，log-rank p=0.0007）。
**αCD40-mSAs疫苗诱导肿瘤新抗原特异性效应细胞毒性T细胞应答**
疫苗接种两周后，G4组淋巴结和脾脏中MC38新抗原（Adpgk）特异性CD8
+ T细胞比例显著升高，TNF-α分泌CD8
+ T细胞频率增加，尤其在脾脏中更为显著。效应记忆T细胞（T
EM; CD44
hi CD62L
lo）在淋巴结中显著增加，与疫苗驱动的抗原 experienced 效应记忆表型一致。
**αCD40-mSAs的体内安全性与毒理学特征**
按疫苗接种方案（108 μg，每周一次，足垫注射，prime-boost-boost），αCD40-mSAs组与PBS对照组相比，体重变化无差异；血清临床化学指标（ALT、AST、CK、BUN、肌酐）及全血细胞计数参数（WBC、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、血红蛋白）均无显著差异，表明在当前给药方案下未检测到器官毒性及明显系统性炎症血液学变化。
**讨论总结**
本研究证实靶向新抗原肽递送对有效肿瘤疫苗治疗至关重要，特别是将新抗原肽与分子佐剂共递送至dLNs中的单个APCs，对于诱导 robust 的新抗原特异性CD8
+ T细胞应答、抑制肿瘤发展 progression 不可或缺。
αCD40-mSAs通过以下机制解决关键挑战：（1）利用IgG抗体天然dLN归巢特性（分子量>84 kDa favor 淋巴引流）；（2）通过CD40靶向APCs，经Fcγ受体介导的CD40交联激活APCs并促进受体介导的内吞；（3）mSA-生物素相互作用实现模块化、稳定的肽负载，保持肽的生物物理学特性。足垫注射虽用于标准化小鼠淋巴引流，临床意图为通过瘤周皮下或皮内注射靶向肿瘤引流淋巴结（TDLN）。
与化学偶联、基因融合等策略相比，mSA-生物素系统更简单、稳定，生物素小分子量（~224 Da）对肽特性影响极小。尽管αCD40-mSAs未能在所有小鼠中实现完全肿瘤消退，但与检查点抑制剂联合或采用多新抗原肽鸡尾酒策略可能进一步优化疗效。未来需构建人CD40反应性αCD40-mSAs以实现临床转化。
**研究结论**
该研究证明了αCD40-mSAs作为肿瘤疫苗新抗原肽递送平台的免疫药理学优势，包括dLN归巢、APC特异性胞内递送和免疫刺激。αCD40-mSAs简单稳定的模块化肽负载特性具有强转化潜力，可增强个性化肿瘤疫苗的效果、通过精确高效的新抗原递送改善临床结局。
