背景：精子主要在附睾头(caput)和附睾体(corpus)转运过程中获得生育能力，成熟后储存于附睾尾(cauda epididymis)。储存期间精子与附睾尾管腔液中的附睾小体(epididymosomes, epEVs，即附睾来源的小细胞外囊泡small EVs)相互作用，可能影响其生育潜能，但该作用尚不明确。目的：以牛为模型探究epEVs对精子生育潜能的影响。材料与方法：从5头公牛附睾尾液中分离epEVs池，对其粒径、浓度、形态及特异性标志物(ALIX、CD81、CD63)进行鉴定。将PKH67绿色荧光标记的epEVs与解冻后附睾尾精子分别以500、1000、2000个epEVs/精子比例孵育1.5、3、6 h以确定互作条件，Hoechst染色后流式细胞术分析绿色荧光阳性百分率及强度代表精子-epEVs互作。检测epEVs中380种microRNAs(miRNAs)谱，取丰度最高的5种miRNA检测精子-epEVs互作后精子内表达量。将互作后精子用于体外受精(In Vitro Fertilization, IVF)生产胚胎并评估发育率。结果：epEVs粒径114.20 ± 3.60 nm，浓度3.48×109± 1.84×108particles/mL，呈杯状形态，ALIX、CD81、CD63阳性。确定最佳互作条件为1000 epEVs/精子孵育3 h，此条件下精子内可检测到epEVs来源的bta-miR-935和bta-miR-421。与对照组相比，epEVs孵育组精子所产胚胎囊胚率(Blastocyst Rate)显著升高(p = 0.04；epEVs组：38.9% ± 7.3%，58/149；对照组：26.6% ± 5.6%，40/145)。讨论与结论：解冻后精子与epEVs以1000 epEVs/精子、3 h孵育可促进体外精子-epEVs互作，提高囊胚率，表明附睾尾epEVs可调控父源对胚胎发育的贡献，为快速动态调控雄性生育力提供了新思路。
本文发表于《Andrology》，研究围绕精子在附睾尾储存期间与附睾来源小细胞外囊泡(epididymosomes, epEVs，简称附睾小体)的相互作用及其对精子受精与支持早期胚胎发育能力（即生育潜能Fertility Potential）的影响展开。现有研究多关注附睾头(caput)和附睾体(corpus)阶段epEVs对精子成熟过程中分子修饰的作用，而精子在附睾尾(cauda epididymis)长时间储存期间是否仍可通过与尾段epEVs互作进一步微调其分子载荷并影响后续胚胎发育，尚不清楚。为此，研究人员以牛为模型，分离鉴定牛附睾尾epEVs，建立精子与epEVs体外共孵育互作模型，验证epEVs源性microRNA(miRNA)向精子的传递，并通过体外受精(In Vitro Fertilization, IVF)评估经epEVs处理的冷冻-解冻附睾尾精子所产胚胎的发育能力，证实附睾尾epEVs与精子在受精前的互作可提升精子支持囊胚发育的能力，为理解父源因子在胚胎发育中的作用及辅助生殖技术中精子质量调控提供了实验依据。
主要关键技术方法：采集5头公牛附睾尾(cauda epididymis)经逆行灌洗获取附睾液，超高速离心法分离附睾小体(epididymosomes, epEVs)并经由纳米颗粒追踪分析(NanoSight)、透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)及流式细胞术检测标志性蛋白(ALIX、CD63、CD81)进行鉴定；取3头公牛冷冻保存的附睾尾精子解冻后经Percoll梯度筛选活精，与PKH67标记epEVs按不同比例(500、1000、2000 epEVs/精子)和时长(1.5、3、6 h)共孵育，Hoechst 33342标记后流式细胞术定量互作效率；采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测epEVs中380种bta-miRNAs表达谱并将丰度前5位miRNA在精子-epEVs互作后行精子内表达检测；将经1000 epEVs/精子、3 h孵育处理组与未加epEVs对照组精子分别与屠宰场采集牛卵巢来源成熟卵母细胞行体外受精(In Vitro Fertilization, IVF)，培养后依次评估首次卵裂率、卵裂率及第168 h囊胚率(Blastocyst Rate)，Hoechst染色计数囊胚细胞数以评估囊胚质量。
研究结果：
3.1 Isolation and Characterization of epEVs
研究人员从5头公牛附睾尾液混合池中经差速离心结合120,000 g超高速离心分离epEVs，纳米颗粒追踪分析显示粒径模式值114.20 ± 3.60 nm、浓度3.48×109± 1.84×108particles/mL；透射电镜确认典型杯状形态；流式细胞术检测显示epEVs高表达外泌体/exosome标志物ALIX、CD63、CD81，线粒体膜蛋白TOM20阴性排除细胞器污染，证实所分离颗粒符合附睾小体(epididymosomes, epEVs)特征。
3.2 epEVs–Sperm Interaction Relies on epEVs:Sperm Ratio and Period of Incubation
研究人员将PKH67标记epEVs与复苏后活精子按500、1000、2000 epEVs/精子分别孵育1.5、3、6 h，流式结果显示精子结合绿色荧光百分比及平均荧光强度均随epEVs比例升高和孵育时间延长而增加(p < 0.0001)，且活细胞延时成像(Time-lapse)显示互作可持续存在于运动精子中并具有非随机、非瞬时特性；对照组(PBS+PKH67无epEVs)荧光信号极低。由此确立后续实验选用中间浓度1000 epEVs/精子与中间时长3 h为互作条件。
3.3 epEVs–Sperm Interaction at a Ratio of 1000 epEVs/Sperm and 3 h of Incubation Resulted in Modulation of Sperm Fertility Potential
qPCR筛查显示380种检测miRNAs中有49种在epEVs中被检出，选取丰度最高的5种(bta-miR-935、-421、-654、-664b、-1260b)检测精子内水平，发现其中bta-miR-935(相对表达fold-change 2.47)和bta-miR-421(fold-change 1.75)在epEVs互作后精子中显著上调，提示epEVs可向精子递送miRNA。体外受精实验显示两组首卵裂率(28 h post-insemination, hpi)无显著差异(p = 0.48)，卵裂率(96 hpi)有升高趋势(p = 0.08)；epEVs处理组囊胚率(168 hpi)为38.9% ± 7.3%(58/149)，显著高于对照组26.6% ± 5.6%(40/145)(p = 0.04)。囊胚细胞数无差异，典型囊胚(Typical blastocyst)比例epEVs组(29.31%)高于对照组(12.50%，p = 0.05)，扩张及孵化囊胚比例无差异，表明epEVs互作主要提升精子支持后期胚胎发育的能力而非早期受精过程。
讨论部分总结：精子沿附睾转运过程中通过与上皮旁分泌及摄取附睾小体(epididymosomes, epEVs)内容物完成分子重塑从而获得受精能力，传统认为主要发生于caput与corpus段，但本研究表明在cauda段储存期间精子仍可借epEVs互作微调分子载荷。研究人员建立了1000 epEVs/精子、3 h体外共孵育诱导精子-epEVs互作的快速操作方案，证实cauda epEVs可将miR-935与miR-421传递给精子，且该互作可提高经体外受精所产胚胎囊胚率，提示附睾尾epEVs参与调控父源对胚胎发育的贡献。功能富集分析提示上述miRNA靶基因涉及自噬(Autophagy)、催产素信号(Oxytocin signaling)、蛋白聚糖(Proteoglycans)及细胞衰老(Cellular senescence)通路。研究局限在于冻存精子已在体内接触过epEVs，体外再暴露属超生理条件，且epEVs还可能携带蛋白、脂质及其他非编码RNA参与调控，需进一步探究。结论翻译如下：以1000个附睾小体(epididymosomes, epEVs)/精子、3 h孵育促进精子与epEVs体外互作并提高囊胚率，表明epEVs可调控父源对胚胎发育的贡献，为快速动态调控雄性生育力及男性不育新疗法提供了依据。
