摘要：氮基阻燃剂（Nitrogen-Based Flame Retardants, NBFRs）广泛用于各类产品中，长期暴露可能致人肝损伤，但其潜在机制尚不清楚。本研究整合网络毒理学、分子对接及孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）分析，系统探究NBFR致肝损伤的机制。研究人员从多个数据库获取NBFR潜在靶基因及肝损伤相关基因，构建蛋白‑蛋白相互作用（Protein‑Protein Interaction, PPI）网络并进行功能富集分析；利用2个肝损伤相关转录组数据集验证核心基因；随后进行分子对接模拟NBFR与核心蛋白的结合相互作用。毒性评估显示NBFR具有显著肝毒性潜力。交集分析鉴定出41个与NBFR暴露及肝损伤相关的基因，经2个转录组数据集交叉验证确认超氧化物歧化酶2（Superoxide Dismutase 2, SOD2）为核心靶基因。分子对接结果显示4种NBFR化合物均与SOD2稳定结合。Cell Counting Kit‑8（CCK‑8）法检测发现NBFR处理以时间依赖性方式显著降低端粒酶永生化人肝上皮细胞‑2（Telomerase‑Immortalized Human Liver Epithelial‑2, THLE‑2）活力；实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）显示SOD2 mRNA显著下调，蛋白质印迹（Western Blot, WB）证实SOD2蛋白表达相应降低。本研究确定SOD2是介导NBFR致肝损伤的关键分子靶标，其具体机制及临床相关性尚需进一步实验验证。
论文解读：氮基阻燃剂通过下调SOD2介导肝毒性的网络毒理学与实验研究
本文发表于《Medicine: Case Reports and Study Protocols》。氮基阻燃剂（Nitrogen‑Based Flame Retardants, NBFRs），包括三聚氰胺（melamine, MEL）、氰尿酸（cyanuric acid, CYA）、氰尿酰胺（ammelide, AMD）及氰尿二酰胺（ammeline, AMN），因高效阻燃及释氮特性被广泛应用于塑料、粘合剂、纺织品及电子产品中。尽管食品污染事件已受管制，NBFRs仍通过日常接触、吸入或摄入进入人体，人群尿液检出率超95%，具环境持久性与广泛暴露特征。现有毒理研究多聚焦于NBFRs致肾损伤（尤其是MEL与CYA共暴露所致晶体性肾病），而其潜在肝毒性机制——肝脏作为外源性物质代谢主要场所——尚未明确。已有实验提示NBFRs可通过氧化应激、线粒体功能障碍、脂质代谢紊乱及炎症信号激活诱导肝细胞损伤，但分子基础及NBFR暴露与肝损伤的因果关联仍待阐明。本研究由Yong Peng、Yueyu Qu、Guanyin Li及Hai Wang开展，采用网络毒理学联合分子对接及体外细胞实验的多学科框架，鉴定NBFR致肝损伤的核心分子靶标与通路，证实超氧化物歧化酶2（Superoxide Dismutase 2, SOD2）为关键介导因子，为环境风险评估与公共卫生防护提供新依据。
主要关键技术方法
研究人员通过PubChem获取4种NBFRs的SMILES结构，利用ADMETlab3平台评估肝毒性；从STITCH、SwissTargetPrediction及TargetNet数据库检索NBFR潜在人源靶基因，从GeneCards以"hepatotoxicity""liver dysfunction""liver injury"检索肝损伤相关基因，取交集得NBFR‑肝损伤相关基因。将交集基因导入STRING数据库构建蛋白‑蛋白相互作用（Protein‑Protein Interaction, PPI）网络（置信度≥0.4），Cytoscape可视化；R语言"ClusterProfiler"包行基因本体论（Gene Ontology, GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析。选用GEO数据集GSE151648（人肝缺血‑再灌注损伤，17例正常vs 23例损伤）与GSE104601（体外肝损伤模型，对照vs脂多糖Lipopolysaccharide, LPS处理），limma包筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs，|logFC|>1，校正P<0.05），与NBFR‑肝损伤基因取交集获核心基因。从PubChem与RCSB PDB获取配体及SOD2蛋白3D结构，CB‑Dock行分子对接（结合能<‑5 kcal/mol为稳定结合）。体外以THLE‑2细胞经1 mmol/L各NBFR处理，CCK‑8测活力，qPCR及Western Blot检测SOD2 mRNA及蛋白表达，统计学采用单因素方差分析及Tukey多重比较（P<0.05为显著）。
研究结果
3.1. Toxicity assessment（毒性评估）
经ADMETlab3预测，4种NBFRs均显示"poor"肝毒性标签，表明其具有显著的人体 hepatotoxic potential（肝毒性潜力）。
3.2. NBFR–liver injury‑associated genes（NBFR‑肝损伤相关基因）
自化学‑基因互作库获176个NBFR潜在靶基因，GeneCards获3581个肝损伤相关基因，韦恩图交集分析鉴定出41个NBFR‑肝损伤共有相关基因。
3.3. Protein interaction network construction（蛋白互作网络构建）
将41个基因导入STRING，过滤后36个基因相互存在互作，导入Cytoscape构建PPI网络并识别枢纽节点。
3.4. Functional enrichment（功能富集分析）
GO分析显示这些基因显著富集于对细菌分子响应、对脂多糖（LPS）响应及对外源刺激响应等生物过程；KEGG分析富集到磷脂酰肌醇‑3‑激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide 3‑Kinase‑Protein Kinase B, PI3K‑Akt）信号通路、脂质与动脉粥样硬化、细胞凋亡及晚期糖基化终末产物‑其受体（Advanced Glycation End‑products–Receptor for AGE, AGE‑RAGE）信号通路。
3.5. External validation（外部验证）
GSE151648筛出2564个DEGs（1025上/1539下），GSE104601筛出630个DEGs（325上/305下）；与前述41个NBFR‑肝损伤基因取三重交集，唯一共同基因为SOD2，确认为NBFR致肝损伤核心靶基因。
3.6. Molecular docking（分子对接）
四种NBFR与SOD2蛋白对接结合能均<‑5 kcal/mol：MEL ‑5.2、CYA ‑5.0、Ammeline(AMN) ‑5.0、Ammelide(AMD) ‑5.3 kcal/mol，表明NBFRs与SOD2存在稳定结合相互作用。
3.7. Cell viability（细胞活力）
CCK‑8检测示1 mmol/L MEL/CYA/AMD/AMN处理THLE‑2细胞24 h及48 h后，细胞活力显著下降且呈时间依赖性，证实NBFRs对肝细胞具细胞毒性。
3.8. Quantitative PCR（实时荧光定量PCR）
NBFR各处理组SOD2 mRNA相对表达量较正常对照组显著下调，表明NBFRs在转录水平抑制SOD2表达。
3.9. Western blot（蛋白质印迹）
WB结果示NBFR处理组SOD2蛋白条带灰度值较对照组显著降低，与qPCR趋势一致，证实NBFRs在蛋白水平下调SOD2表达，可能通过削弱线粒体抗氧化防御致肝细胞功能受损。
讨论与结论
讨论指出，SOD2是线粒体内关键抗氧化酶，催化超氧阴离子转化为过氧化氢与氧气以维持细胞 redox稳态；NBFR与SOD2的稳定结合及后续SOD2表达下调可致线粒体活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）蓄积，引发线粒体功能障碍、脂质过氧化及DNA损伤，最终通过氧化应激轴致肝损伤。研究局限含未考量基因‑环境交互作用、仅涵盖4种代表性NBFR及有限肝毒性标志物，需扩大化合物范围并结合体内实验进一步验证。
结论：本研究确定SOD2是介导氮基阻燃剂（NBFRs）致肝损伤的关键分子，SOD2下调可能是NBFR暴露与肝细胞功能障碍间的重要分子链接。该发现为阐明NBFR肝毒机制提供新证据，并提示SOD2可作为潜在生物标志物及治疗靶点，其具体信号通路及流行病学意义尚需进一步实验确认。
