本研究评估了来源于Justicia spicigera叶片的七种提取物（浸剂infusion、煎剂decoction及超声辅助有机溶剂提取）的体外抗氧化及抗糖尿病（antidiabetic）活性。采用固相萃取（solid-phase extraction, SPE）将各提取物分为水相组分（aqueous fraction, AF）与50%甲醇水相组分（50% aqueous methanol fraction, AMF），并分别定量总可溶性酚类（total soluble phenols, TSP，以没食子酸当量gallic acid equivalents, GAE计）与总黄酮（total flavonoids, TF，以槲皮素当量quercetin equivalents, QE计）。经高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS）分析14个SPE组分，鉴定出三种酚类成分：甘草素（liquiritigenin）仅存在于AF中；山奈酚二鼠李糖苷即山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李吡喃糖苷（kaempferitrin，化合物1）与山奈酚（kaempferol，化合物2）均恒定出现在所有AMF中，表明这些成分具有组分特异性分布规律。相关性分析揭示两分组的生物活性模式存在差异：AF中TF与α-amylase抑制呈强负相关（r = -0.774），而AMF中TF与DPPH•自由基清除能力呈显著关联（r = -0.755）。70%乙醇超声辅助提取物（70% aqueous ethanol ultrasound-assisted extract, EEAUS）表现出最高水平酚类物及酶抑制效应。自该活性提取物中通过色谱法分离得到两种黄酮类化合物并经一维及二维核磁共振（one- and two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance, 1D and 2D NMR）鉴定为kaempferitrin（化合物1）及首次自J. spicigera中报道的山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷-7-O-α-L-鼠李吡喃糖苷（kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside，化合物2）。上述结果突显提取方法对富集具抗氧化及抗糖尿病活性化合物的关键作用。
论文解读：Justicia spicigera叶提取物抗氧化特性与α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制能力关系的研究
Justicia spicigera Schlechtendal（俗称muicle或muite），属爵床科（Acanthaceae），是墨西哥传统药用植物，民间用于治疗胃肠疾病、心脏病、贫血及糖尿病。既往研究表明其茎部具体内抗糖尿病作用，乙醇提取物对糖尿病大鼠肝脏具保护作用，且富含多酚类物质，但叶提取物通过抑制碳水化合物消化酶——α-淀粉酶（α-amylase）与α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）延缓餐后高血糖这一2型糖尿病预防机制尚未被评价。此外，不同提取方法对该植物叶中酚类组分的极性分布及相应抗氧化、酶抑制活性的影响亦缺乏系统研究。因此研究人员拟阐明J. spicigera叶不同提取物经固相萃取（solid-phase extraction, SPE）所得水相组分（aqueous fraction, AF）与50%甲醇水相组分（50% aqueous methanol fraction, AMF）中总可溶性酚类（total soluble phenols, TSP）、总黄酮（total flavonoids, TF）含量与DPPH•自由基清除、α-amylase及α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性，并分离鉴定主要活性黄酮成分。该论文发表于《Phytomedicine Plus》。
研究人员采集墨西哥瓦哈卡州米斯特卡地区Asuncion Cuyotepeji的J. spicigera植株地上部分，标本保存于Chapingo自治大学标本馆（编号25224）。制备七种叶提取物：鲜叶煎剂（decoction of fresh leaf, DFL）、干叶煎剂（decoction of dried leaf, DDL）、干叶浸剂（infusion of dried leaf, IDL）、水超声辅助提取（aqueous ultrasound-assisted extraction, AEAUS）、70%丙酮超声辅助提取（70% aqueous acetone ultrasound-assisted extraction, ACEAUS）、70%乙醇超声辅助提取（70% aqueous ethanol ultrasound-assisted extraction, EEAUS）、甲醇超声辅助提取（methanol ultrasound-assisted extraction, MEAUS）。各粗提物经C18固相萃取柱分为AF（水洗脱）与AMF（甲醇-水1:1洗脱）。主要检测指标含提取率、TSP（Folin-Ciocalteu法，GAE单位）、TF（亚硝酸钠-氯化铝比色法，QE单位）、HRMS鉴定酚类成分、DPPH•清除IC50及抗自由基效率（antiradical efficiency, AE）、α-amylase抑制IC50（以马铃薯淀粉为底物，DNS显色）、α-葡萄糖苷酶抑制IC50（以对硝基苯基-α-D-葡萄糖吡喃糖苷p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, PNGP为底物），活性最高之EEAUS经液液萃取及常压硅胶柱色谱、制备薄层色谱分离纯化单体黄酮，并以1H NMR、13C NMR、异核单量子相干谱（gradient Heteronuclear Single Quantum Coherence, gHSQC）及异核多键相关谱（gradient Heteronuclear Multiple Bond Correlation, gHMBC）鉴定结构。数据经Shapiro-Wilk正态性与Levene方差齐性检验后行单因素方差分析与Duncan多重比较（p < 0.05），Pearson相关系数评价TSP、TF与各生物活性指标间线性关系。
3.1. Extracts obtention（提取物得率）
七种方法提取率差异显著（p < 0.001），AEAUS得率最高（32.3 ± 2.3%），IDL（30.0 ± 2.0%）、DDL（29.1 ± 2.6%）及MEAUS（29.1 ± 2.3%）与之相当，EEAUS（24.3 ± 1.3%）与ACEAUS（20.7 ± 1.1%）较低，说明水溶性酚类使水基方法提取效率较高。
3.2. Total soluble phenols (TSP)（总可溶性酚含量）
DFL及各组分总和（687.2 ± 0.01 GAE mg·(100 g FW)-1）与EEAUS及各组分总和（486.05 ± 0.01 GAE mg·(100 g FW)-1）TSP含量最高，超声辅助醇-水混合溶剂利于多酚（含糖基亲水片段）高效溶出。
3.3. Total flavonoids (TF)（总黄酮含量）
SPE去除了干扰测定的叶绿素，TF以QE计。浸剂较煎剂TF高，EEAUS TF最高（492.15 ± 5.77 QE mg·(100 g FW)-1），与TSP趋势一致。
3.4. Mass spectrometry of fractions（组分质谱分析）
HRMS分析14个SPE组分确证三酚类：甘草素（liquiritigenin, C15H12O4，[M-H]-m/z 255.0657，实测m/z 255.2320）仅见于AF（除EEAUS-AF未检出）；山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李吡喃糖苷（kaempferitrin，化合物1，C27H30O14，[M-H]-m/z 577.1558，实测m/z 577.1557）与山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷-7-O-α-L-鼠李吡喃糖苷（kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside，化合物2，C26H28O14，[M-H]-m/z 563.1403，实测m/z 563.1397）仅见于AMF，且化合物1在所有AMF中相对强度100%，显示明显极性分组分布特征；EEAUS-AF无liquiritigenin提示溶剂组成影响溶解与稳定性。
3.5. DPPH• radical-scavenging activity（DPPH•自由基清除活性）
EEAUS-AF IC50最低（55.75 kg干样·(kg DPPH•)-1），AEAUS-AF抗自由基效率（AE = 1/(IC50× TIC50)）最高（1.24 × 10-3kg DPPH•·(kg干样·min)-1），超声辅助提取AF抗氧化效能优于AMF。
3.6. In vitro α-amylase and α-glucosidase inhibitory activity（体外α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶抑制活性）
α-amylase抑制最强者为EEAUS-AF（IC50= 221.4 ± 1.6 μg·mL-1）与IDL-AF（IC50= 226.0 ± 2.6 μg·mL-1）；α-葡萄糖苷酶抑制最强者为EEAUS-AMF（IC50= 105.7 ± 3.5 μg·mL-1）、DFL-AMF（IC50= 111.4 ± 4.6 μg·mL-1）及EEAUS-AF（IC50= 115.7 ± 4.5 μg·mL-1），部分组分IC50低于阳性药阿卡波糖（acarbose），J. spicigera提取物整体对α-葡萄糖苷酶抑制力强于α-淀粉酶，EEAUS-AF与EEAUS-AMF同时具双酶抑制能力且与高TSP相符。
3.7. Pearson's correlations（Pearson相关性分析）
AF组中TSP与α-amylase IC50呈强负相关（r = -0.790, p = 0.034），TF与α-amylase IC50呈强负相关（r = -0.774, p = 0.041），α-amylase与α-葡萄糖苷酶IC50呈强正相关（r = 0.914, p = 0.0039）；AMF组中TSP与TF呈极强正相关（r = 0.93, p = 0.002），TF与DPPH• IC50呈显著负相关（r = -0.755, p = 0.050），α-amylase与α-葡萄糖苷酶IC50亦呈强正相关（r = 0.846, p = 0.016）。表明AF酚/黄酮驱动酶抑制，AMF黄酮贡献自由基清除，双酶抑制在两分组中均协同关联。
3.8. Spectroscopic characterization of kaempferitrin (1) and kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside (2)（黄酮化合物波谱表征）
自EEAUS乙酸乙酯相经硅胶柱色谱分离获得黄色晶体化合物1（kaempferitrin，产率7.2%）与化合物2（kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside，产率2%），1H及13C NMR比对文献确认化合物1；化合物2之1H NMR示山奈酚B环AA'XX'偶合双重峰（H-2',6' δ 8.20；H-3',5' δ 6.89）、A环间位偶合H-8 δ 6.83与H-6 δ 6.45，鼠李糖端基氢H-1‴ δ 5.55 (d, J = 1.8 Hz)及甲基δ 1.12 (d)，阿拉伯吡喃糖端基氢H-1″ δ 5.35 (d, J = 4.8 Hz)及亚甲基H-5″ δ 3.57/3.20，gHMBC中H-1‴相关C-7（δ 161.6）确认7-O-鼠李糖，H-1″相关C-3（δ 133.8）确认3-O-阿拉伯吡喃糖，gHSQC辅助归属，此为J. spicigera中首次发现化合物2。
讨论与结论总结
J. spicigera SPE组分HRMS确证liquiritigenin（多现于AF）、kaempferitrin（化合物1）与kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside（化合物2，首报于该种）（均现于AMF）。Pearson分析示AF中TF(r=-0.774)及TSP(r=-0.790)与α-amylase抑制IC50负相关、双酶IC50正相关(r=+0.914)；AMF中TSP-TF强共变(r=+0.93)、TF与DPPH•清除IC50负相关(r=-0.755)、双酶IC50正相关(r=+0.846)。70%乙醇超声辅助提取物（EEAUS-AF）酚/黄酮含量最高且酶抑制最强。kaempferitrin（化合物1）为AMF普遍标志物，化合物2首自J. spicigera分离鉴定。结果证实生物活性酚/黄酮具极性依赖分配，J. spicigera叶提取物尤EEAUS具作为靶向抗糖尿病制剂之潜力。
