摘要：背景——致心律失常性心肌病（Arrhythmogenic Cardiomyopathy, ACM）是一种遗传性心脏桥粒（desmosome）疾病，超过50%的患者携带桥粒蛋白编码基因致病性变异。本研究聚焦ACM患者、健康亲属（Healthy Relatives, HR）及小鼠ACM模型中，靶向闰盘（Intercalated Disc, ICD）蛋白如桥粒芯糖蛋白2（Desmoglein-2, DSG2）的致病性及非致病性自身抗体的作用与机制。材料与方法——分离自ACM患者、HR、健康对照及小鼠ACM模型的IgG组分，在小鼠心脏切片、HL-1细胞或诱导多能干细胞来源心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）中分别进行ELISA、裂解（cleavage）实验、解离（dissociation）实验、免疫染色、Triton X-100提取实验、Western blot及原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）检测。结果——ACM患者及HR来源的IgG（而非小鼠ACM模型来源或分组健康对照IgG，Grouped Healthy Control IgG, G-HC）呈ICD阳性染色。6例ACM患者中3例来源IgG可降低心肌细胞黏附性。致病性自身抗体结合健康及ACM hiPSC-CMs中的DSG2，在分子水平裂解并减少DSG2相互作用。研究人员探究了糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β, GSK-3β）对心肌细胞黏附丧失的贡献，观察到GSK-3β降低培养心肌细胞及心脏切片的基线黏附性。在5种ACM-IgG及3种受检HR-IgG中，3种致病性ACM-IgG在上游p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogen-Activated Protein Kinase, p38MAPK）之前激活GSK-3β，导致β-连环蛋白（β-catenin, β-cat）磷酸化及连接处丢失。GSK-3β抑制可挽救ACM hiPSC-CMs中的细胞黏附丧失。结论——ACM患者中存在靶向DSG2的致病性自身抗体，并以GSK-3β依赖性方式损害心肌细胞黏附。相比之下，小鼠ACM模型中无此类自身抗体，且部分ACM患者及HR中自身抗体无致病性。
论文解读：致心律失常性心肌病（ACM）患者体内自身抗体激活GSK-3β导致心肌细胞黏附丧失
致心律失常性心肌病（Arrhythmogenic Cardiomyopathy, ACM）是一种以右心室或双心室进行性纤维脂肪替代为特征的遗传性心肌病，是青壮年尤其是运动员心脏性猝死（Sudden Cardiac Death, SCD）的重要原因之一。超过50%的ACM患者携带桥粒（desmosome）蛋白编码基因（如PKP2、DSP、DSG2、DSC2、JUP）的致病性变异，但仍有35%–50%患者未检出已知基因突变，提示存在非遗传学发病机制。闰盘（Intercalated Disc, ICD）中的桥粒蛋白负责相邻心肌细胞间的机械黏附，其功能障碍可导致细胞脱黏（loss of cohesion）。近年研究发现ACM患者血清中存在靶向桥粒芯糖蛋白2（Desmoglein-2, DSG2）的自身抗体，类比天疱疮（pemphigus）中抗DSG自身抗体破坏皮肤桥粒黏附的机制，提示自身抗体可能参与ACM心肌细胞黏附损伤。然而，ACM中自身抗体的确切作用、致病性差异及其下游信号机制尚不清楚。本研究由Waschke J等发表于《Acta Physiologica》，旨在明确ACM患者及健康亲属（Healthy Relatives, HR）血清IgG中抗ICD/抗DSG2自身抗体的存在、致病性异质性，阐明其通过GSK-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β）信号通路导致心肌细胞黏附丧失的分子机制，并评估GSK-3β抑制的治疗潜能。
研究人员收集8例ACM患者（含PKP2、DSP、DSG2、MYH7基因变异）、3例HR及6例健康对照（Healthy Control, HC）血清，分离IgG；同时取Pkp2−/−和Jup−/−小鼠ACM模型及同窝野生型小鼠血清IgG。使用HL-1小鼠心房心肌细胞系、人源hiPSC-CMs（来自健康供体NP0040-8及携带DSP c.2854G>T; p.Glu952*变异的ACM先证者NP0151-11F和患者NP0153-5）及人/小鼠心室组织切片，采用Dispase-based解离（dissociation）实验评估细胞黏附强度；免疫荧光检测IgG与DSG2/ICD共定位；ELISA检测抗DSG2-His结合；体外DSG2-Fc裂解（cleavage）实验与无细胞条件下原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）检测DSG2同源结合频率；Triton X-100提取分离细胞骨架与非细胞骨架组分，Western blot检测pGSK-3β(Ser9)、pp38MAPK、pβ-catenin(β-cat, Ser33/37/Thr41)及连接蛋白表达；并使用GSK-3β特异性抑制剂SB216763（SB21）和p38MAPK抑制剂SB202190（SB20）进行挽救实验。
2.1 ACM患者IgG结合hiPSC-CMs中DSG2并引起黏附丧失
研究人员用ACM 1（DSP）和ACM 15（PKP2）患者IgG处理健康男性hiPSC-CMs，Dispase解离实验显示较分组健康对照IgG（Grouped Healthy Control IgG, G-HC）产生显著更多细胞碎片，证实ACM-IgG可致人类心肌细胞黏附丧失。ELISA显示ACM 1-IgG结合重组DSG2-His蛋白。免疫荧光与STED超高分辨成像显示ACM-IgG与活细胞表面DSG2共定位（Pearson相关系数正相关），1 h即出现膜结合，24 h见内吞，而健康对照IgG无此现象。
2.2 新ACM患者队列IgG显示抗ICD抗体但仅部分致黏附丧失
新入组6例ACM患者及3例HR的IgG在HL-1细胞解离实验中，ACM 22、26、27-IgG致黏附丧失，ACM 28、29及所有HR-IgG无此效应。人心室组织免疫染色显示所有ACM-IgG和HR-IgG均与N-钙粘蛋白（N-Cadherin, N-CAD）标记的ICD共染，提示自身抗体（抗ICD/抗DSG2）普遍存在于ACM患者及HR血清中，但仅部分具致病性（致黏附丧失）。小鼠Pkp2−/−和Jup−/−ACM模型IgG在HL-1细胞及小鼠心脏切片中既不降低黏附也不染ICD，表明桥粒靶向自身抗体为人类ACM特有现象，小鼠模型不自发产生。
2.3 ACM患者IgG具催化活性并降低DSG2同源结合
ACM 1、26、27-IgG在无蛋白酶抑制剂条件下可裂解130 kDa DSG2-Fc胞外段产生100 kDa片段，ACM 22-IgG无裂解活性。无细胞AFM实验显示ACM 22、26、27-IgG均显著降低DSG2-Fc同源结合频率，提示致病性IgG可通过催化裂解（ACM 26、27）和/或空间位阻（steric hindrance，ACM 22）干扰DSG2同源相互作用。
2.4 ACM患者自身抗体引起GSK-3β激活
HL-1细胞经ACM 1、26、27-IgG处理1 h后，Triton X-100提取与Western blot显示非细胞骨架组分中GSK-3β Ser9磷酸化降低（激活态），p38MAPK激活，细胞骨架组分中β-cat Ser33/37/Thr41磷酸化增加；ACM 22-IgG激活p38MAPK和β-cat磷酸化但未显著改变GSK-3β Ser9磷酸化。HR-IgG及非致病ACM-IgG（ACM 28、29）均无GSK-3β或p38MAPK激活效应。24 h处理后激活信号消失。DSG2和N-CAD总蛋白量24 h内无变化。
2.5 ACM-IgG引起hiPSC-CMs黏附丧失可被GSK-3β抑制挽救
ACM 1和ACM 22-IgG处理健康及ACM患者来源hiPSC-CMs均增加解离碎片数（ACM 22仅于ACM-hiPSC-CMs中显著）。预孵育GSK-3β抑制剂SB216763（SB21）可增强HL-1细胞、野生型及Jup−/−小鼠心脏切片中心肌细胞基线黏附；SB21预处理完全挽救ACM-IgG（ACM 1、22、26）引起的HL-1细胞和hiPSC-CMs黏附丧失。
2.6 抑制GSK-3β恢复连接处β-cat并失活p38MAPK
ACM 1或ACM 26-IgG加SB21共处理HL-1细胞，Western blot显示β-cat磷酸化及p38MAPK磷酸化被显著抑制；免疫荧光示SB21恢复ACM 1-IgG造成的连接处β-cat减少。p38MAPK抑制剂SB202190同样挽救ACM-IgG致黏附丧失，确认p38MAPK位于GSK-3β下游。
讨论与结论
本研究表明ACM患者及部分HR血清中存在抗ICD/抗DSG2自身抗体，其在ACM患者中部分为致病性——通过结合DSG2造成催化裂解或空间位阻削弱桥粒同源黏附，并激活GSK-3β→上游激活p38MAPK→β-cat磷酸化降解及连接处丢失，最终致心肌细胞脱黏。非致病性自身抗体存在于HR中但不激活GSK-3β/p38MAPK通路，提示自身抗体形成可能先于临床发病且与遗传易感性有关（家族聚集），符合表位扩展（epitope spreading）假说。小鼠ACM模型不产此类自身抗体，故不能模拟自身免疫成分。GSK-3β抑制剂可挽救自身抗体介导的黏附损伤，为ACM潜在治疗提供线索。自身抗体检测或成为基因阴性ACM的辅助诊断标志。
结论翻译：致心律失常性心肌病（ACM）患者中存在靶向桥粒芯糖蛋白2（DSG2）的致病性自身抗体，并以糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）依赖性方式损害心肌细胞黏附。相比之下，小鼠ACM模型中无此类自身抗体，且部分ACM患者及健康亲属（HR）中自身抗体无致病性。
