体外碱性彗星试验结合肝脏模型作为N-亚硝胺遗传毒性评估的补充工具

药物中的N-亚硝胺（NA）杂质因其具有致突变/致癌潜能，并涉及细胞色素P450（CYP）介导的代谢活化，在ICH M7(R2)中被归类为“高度关注队列（cohort of concern）”化合物。随着基于哺乳动物细胞的遗传毒性/致突变性检测方法日益受到关注，研究人员评估了体外碱性彗星试验对于NA的预测能力。研究中考察了精密切割肝切片（PCLiS）、原代人肝细胞（PHH）、原代大鼠肝细胞（PRH）以及加入大鼠或仓鼠S9-mix的HepG2细胞，作为体外模型系统。研究首先对其代谢能力进行了预先表征。为评价检测性能，测试了一组已知致突变化合物[亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙醇胺、N-亚硝基甲基苯胺、S–N-亚硝基降烟碱、N-甲基-N-亚硝基-2-丙胺]和报道为非致突变化合物（methyl-t-butylnitrosamine、N-亚硝基脯氨酸），并联合检测了药物原料药相关亚硝胺杂质[N-亚硝基地氯雷他定、N-亚硝基叶酸、N-亚硝基氟西汀（NFluo）]，测试浓度范围为0.005–10 mM。经2 h处理（PCLiS、PHH和PRH）或4 h处理（HepG2）后，NDMA在所有体外模型中均以浓度依赖方式诱导DNA链断裂。不同肝细胞模型对致癌性NA预测的灵敏度/特异度分别为：加入仓鼠S9-mix的HepG2细胞为100%/50%，PHH和PRH为50%/100%，加入大鼠S9-mix的HepG2细胞为50%/50%。基准剂量（BMD）建模显示，在所有细胞系统中，NFluo相较于NDMA表现出更高的体外彗星试验相对反应。综上，体外彗星试验可作为预测致突变性NA时对法规体外检测的高灵敏度和/或高特异度补充工具。然而，在将其纳入遗传毒性标准检测组合之前，仍需通过扩展化合物训练集并对肝细胞模型进行充分验证，以开展进一步优化工作。

该文发表于《Archives of Toxicology》，围绕药物中N-亚硝胺（NA）杂质的遗传毒性评估展开，核心目标是判断体外碱性彗星试验是否可作为现行监管检测体系的重要补充工具。研究背景在于：NA因具有显著的致突变性和致癌性，被ICH M7(R2)列为“高度关注队列（cohort of concern）”物质。大量NA的毒性作用依赖细胞色素P450（CYP）介导的代谢活化，尤其是α-羟化后生成可与DNA共价结合的高反应性中间体，进而形成DNA加合物，引发DNA复制错误、DNA链断裂和基因突变，最终促进肿瘤发生。然而，针对药物原料药相关亚硝胺杂质（NDSRIs），目前普遍缺乏化合物特异性的致癌性数据，给可接受摄入量（AI）的确定和风险评估带来困难。现有基于两种互补性（Q）SAR模型和Ames试验的监管框架，对于NA这一类依赖代谢活化的前致突变化合物存在明显局限，尤其是常规Ames试验在NA检测中的灵敏度不足、外源代谢活化体系不充分、结果不一致等问题较为突出。尽管增强型Ames试验（EAT）通过采用仓鼠来源S9组分提升了灵敏度，但特异度偏低仍是现实障碍。因此，采用具有代谢能力的哺乳动物肝脏模型开展体外遗传毒性评估，具有明确的现实必要性。

在这一背景下，研究人员系统评估了体外碱性单细胞凝胶电泳试验，即彗星试验（SCGE or comet assay），并选择肝脏作为关键靶器官相关模型。原因在于，肝脏是多种经口摄入NA最敏感的靶器官之一，同时也是机体代谢能力最强的组织。研究纳入了精密切割肝切片（PCLiS）、原代人肝细胞（PHH）、原代大鼠肝细胞（PRH）以及需外加代谢活化体系的HepG2细胞，并分别结合大鼠或仓鼠S9-mix进行检测。研究使用10种NA构成测试面板，既包括已知致突变/致癌的代表性化合物，也包括已报道的非致突变/非致癌物以及若干遗传毒性不明确的NDSRIs，以比较不同模型系统在DNA损伤检出上的灵敏度、特异度及相对反应强弱。

主要技术方法可概括如下：研究首先通过文献检索建立NA相关体内外彗星试验信息基础，并据此筛选化合物面板。实验模型包括来源于部分肝切除女性患者肝组织的PCLiS、商业化10位供体混合来源PHH、Wistar雄性大鼠分离的PRH及HepG2细胞。研究采用液相色谱-质谱联用（LC–MS）检测CYP底物代谢以表征代谢能力，并辅以实时定量PCR（qRT-PCR）验证部分CYP mRNA表达。随后以体外碱性彗星试验测定DNA链断裂，以尾强度（TI）为终点；并通过统计检验、灵敏度/特异度计算及基准剂量（BMD）建模，对不同模型和不同NA的反应进行比较分析。

研究结果部分首先报告了文献检索情况。研究人员发现，既往关于NA的彗星试验文献中，肝脏相关模型占据较大比例，其中HepG2最常被使用，尽管其内源性代谢能力较弱。被研究最多的NA为NDMA和N-亚硝基二乙胺（NDEA），提示现有证据主要集中于高致癌效力的小分子NA，而结构更复杂NDSRIs的数据相对匮乏。这一发现为本研究扩大化合物类型和比较不同肝模型的设计提供了依据。

在“代谢能力检测”部分，研究显示，与HepG2相比，S9组分和原代肝细胞均具有与NA代谢活化密切相关的关键CYP酶活性，尤其是CYP2E1和CYP2A6。HepG2细胞本身几乎不具备可检测的代谢能力，因此必须依赖外源S9-mix。PHH中虽未在酶活水平上检测到CYP2E1活性，但qRT-PCR证实其相关mRNA仍有表达，提示培养条件可能影响其功能状态。

在“体外碱性彗星试验”结果中，NDMA作为阳性参考物，在所有5种肝脏模型中均可浓度依赖性诱导DNA链断裂，且未见明显细胞毒性，证明这些模型总体具备检测代谢活化型NA DNA损伤的能力。作为阴性参考物，N-亚硝基脯氨酸（NPro）在全部模型中均未诱导DNA链断裂，支持试验具有一定特异性。另一阴性候选物methyl-t-butylnitrosamine（NMtBu）在PHH和PRH中为阴性，但在加大鼠或仓鼠S9-mix的HepG2中呈轻度阳性，研究认为其生物学相关性存疑，这也解释了部分模型特异度下降的原因。

在“已知致突变/致癌NA的检测表现”部分，NDELA在PHH、PRH及两种S9条件下的HepG2中均诱导DNA链断裂；而S-NNN和NMA仅在加入仓鼠S9-mix的HepG2细胞中呈阳性，在其他肝模型中未检出。基于参考化合物的已知致癌性信息，研究计算得出：PHH和PRH对致癌性NA的灵敏度均为50%，特异度均为100%；加入仓鼠S9-mix的HepG2灵敏度达到100%，但特异度为50%；加入大鼠S9-mix的HepG2灵敏度和特异度均为50%。若以体内/体外致突变性作为判定标准，则PHH和PRH的灵敏度/特异度为67%/100%，仓鼠S9-HepG2为100%/67%，大鼠S9-HepG2为50%/67%。这些结果表明，原代肝细胞模型更具特异性，而仓鼠S9-HepG2更具灵敏性。

在“未知或不确定遗传毒性NA的检测”部分，NMIPA在PHH、PRH和仓鼠S9-HepG2中均可增加DNA链断裂，而在大鼠S9-HepG2中为阴性。N-亚硝基叶酸（NFA）在所有模型中均未诱导DNA损伤，与其后续被认定为非致突变杂质（NMI）的结论一致。N-亚硝基地氯雷他定（NND）仅在仓鼠S9-HepG2中显著阳性，在PRH中虽有超过2倍的TI升高但无统计学显著性。N-亚硝基氟西汀（NFluo）则是最突出的NDSRI，在全部4种细胞模型中均于较低浓度诱导明显DNA链断裂，且强于其母体化合物氟西汀（Fluo）；而Fluo本身不引起DNA链断裂，提示所观察到的遗传毒性效应与N-亚硝基官能团密切相关。

在“BMD建模”部分，研究利用BMD₁₀₀对阳性结果进行浓度-反应定量比较。结果显示，在PHH中，体外彗星试验反应强度排序为NFluo > NDMA > NDELA > NMIPA；在PRH中，NFluo与其余阳性化合物明显分离，表现出更高反应强度；在大鼠S9-HepG2中，NFluo的反应也高于NDMA；在仓鼠S9-HepG2中，可区分出高反应组与低反应组，NFluo持续位于高反应范围。总体而言，NFluo在所有可比较系统中的BMD₁₀₀置信区间均位于比NDMA更低的浓度范围，提示其在体外彗星试验中的相对DNA损伤反应更强。

讨论部分强调，短时暴露条件下，体外碱性彗星试验主要反映DNA N-烷基化损伤及其经碱基切除修复（BER）形成的无嘌呤/无嘧啶位点和单链断裂，因此更敏感于某些早期DNA损伤事件，而未必直接等同于可遗传性突变。研究同时指出，外源S9体系虽可提高某些模型的灵敏度，但也可能因活化代谢物需跨越细胞膜和核膜、或在胞外发生副反应而影响结果解释。原代细胞尤其PHH更接近体内代谢环境，兼具Ⅰ相和Ⅱ相代谢能力，理论上更利于结果向人体外推，但其可获得性差、成本高、批次差异和代谢活性衰减等问题限制了其标准化应用。PRH虽具备较强代谢能力，但基础尾强度波动较大。HepG2加仓鼠S9-mix则适合采取保守策略的危害识别，优点是高灵敏度，缺点是较低特异度可能导致过度预测。

研究结论可译述如下：体外彗星试验是对现有法规体外检测方法进行补充、用于预测致突变性N-亚硝胺的一种具有高灵敏度和/或高特异度的工具。在需要识别相关代谢物、明确DNA链断裂类型，或因抗生素等原因不适合采用细菌致突变性试验时，该方法可能尤其有价值。作为细胞模型，原代细胞，特别是PHH，因其代谢能力及与体内环境的相似性，优于肿瘤细胞系，但作为标准检测模型仍存在一定局限。基于肝脏模型的体外彗星试验目前已可作为整体证据权重（weight of evidence）方法的一部分加以考虑；但在其被纳入NA遗传毒性标准检测组合之前，仍需进一步优化，包括扩展训练化合物集合，并对合适且广泛可获得的肝细胞模型进行充分验证。