柱前衍生化高效液相色谱法测定干蔬菜中总二氧化硫残留量

<摘要>
二氧化硫（Sulfur dioxide, SO₂）及其衍生物常作为防腐剂应用于干蔬菜中，但残留过量会对食品安全构成重大威胁。本研究将柱前2,2'-二硫代双(5-硝基吡啶)（2,2'-dithiobis(5-nitropyridine), DTNP）衍生化高效液相色谱（High-performance liquid chromatography, HPLC）法应用于高淀粉和多糖含量的干蔬菜样品中。检测波长向320 nm的调整显著缓解了213 nm下观察到的严重基质干扰经验证的方法显示出优异线性关系（R² > 0.9999），线性范围为3.20-51.2 mg/L，在干蔬菜样品中的检出限（Limit of Detection, LOD）和定量限（Limit of Quantification, LOQ）分别为0.0039和0.013 g/kg，基质效应控制在±10%以内，加标回收率为79.17%–115.04%。对19个市售样品的应用表明，所有银耳（Tremella fuciformis）样品的总SO₂残留量均符合GB 2760-2024规定的最大残留限量（Maximum Residue Limit, MRL）0.2 g/kg，而来自甘肃省的一个百合（Lilium spp.）样品总SO₂残留量为4.05 g/kg，超出MRL约20倍。膳食暴露评估显示，成人高暴露情景下的危害商（Hazard Quotient, HQ）为0.984。所提出的方法为干蔬菜中SO₂的日常监管提供了一种灵敏且针对基质的分析工具。

<论文解读>
干蔬菜（Dried vegetables）作为中国广泛消费的主要商品，因其保质期长和保留的营养价值而备受推崇（Deng et al., 2019; Zhang et al., 2017）。在干蔬菜的加工过程中，二氧化硫（Sulfur dioxide, SO₂）及其亚硫酸盐衍生物被常规用作漂白剂和防腐剂，通过抑制多酚氧化酶介导的酶促褐变和抑制微生物生长来发挥作用（D'Amore et al., 2020; Li et al., 2024）。尽管根据GB 2760-2024标准，干蔬菜中SO₂的最大残留限量（Maximum Residue Limit, MRL）已设定为0.2 g/kg，但非法超量使用的现象依然普遍。全国23个省份的监测数据显示，干蔬菜样品中SO₂的检出率为70.3–80.0%，部分区域调查报告的超标率高达30.09%，平均残留浓度高达2170 mg/kg（He et al., 2020; Lou et al., 2017; National Health Commission of PRC, 2024）。鉴于这些合规性担忧，开发准确可靠的SO₂残留分析方法对于食品安全监管至关重要。目前，官方监管机构采用的Monier-Williams（MW）蒸馏法虽为标准方法，但存在分析时间长且易受内源性硫化合物干扰导致假阳性结果的问题（Department of Health and Human Services of Food and Drug Administration, 2022; Lim et al., 2014）。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）虽灵敏且特异，但甲醛衍生化存在潜在安全隐患，且背景干扰复杂，难以准确确定检出限（Robbins et al., 2015）。气相色谱-质谱法（GC-MS）则面临分析物在色谱系统中吸附以及总SO₂测定中乙醛高浓度干扰的问题（Carrascon et al., 2017）。与此同时，新兴传感技术虽具快速响应潜力，但稳定性受限，例如表面增强拉曼散射（SERS）银基底在热或激光照射下易氧化、腐蚀和信号衰减（Kong et al., 2021）。高效液相色谱法（HPLC）广泛用于食品基质中亚硫酸盐的定量，亚硫酸根离子在213 nm处具有最大紫外吸收，因此直接HPLC分析通常采用该波长作为检测条件（Yang et al., 2019）。然而，213 nm的直接紫外检测易受内源性化合物干扰，如藻酸钠等多糖在该波长下有特征吸收峰，导致分析物信号严重光谱重叠（Derkach et al., 2022）。此外，深紫外光在穿过含有残留多糖、淀粉或蛋白质聚合物的复杂食品提取物时会发生强烈散射，干扰短波长区域内的本征吸收测量（Taniguchi & Lindsey, 2024）。利用2,2'-二硫代双(5-硝基吡啶)（DTNP）进行柱前衍生化可通过硫醇-二硫化物交换反应解决这一限制，亚硫酸根离子以1:1的化学计量比裂解DTNP的S–S键，生成在320 nm处强吸收的硫代磺酸盐衍生物（RSSO₃^-）（Ren et al., 2022; Yang et al., 2019）。该DTNP-HPLC方法已成功应用于虾中亚硫酸盐的分析，但将其应用于富含淀粉和多糖的复杂干蔬菜基质的研究仍存在空白。现有DTNP方案在这些基质中的适用性尚未得到证实，因为其固有的复杂性可能阻碍提取效率并引入新的干扰或分析物损失来源。

为了解决上述问题，研究人员将DTNP-HPLC法扩展应用于此类干蔬菜基质，以测定总SO₂残留量。研究人员采用温和的超声辅助提取 protocol，使用正丙醇（n-propanol）来稳定亚硫酸盐，同时最大限度地减少淀粉和多糖引起的基质效应，并进行了全面的方法验证，以确认其适用于常规监管监测。为开展研究，研究人员从北京实体零售店和在线平台淘宝于2026年1月15日至5月5日期间购买了19个市售样品，包括10个百合（Lilium spp.）样品和9个银耳（Tremella fuciformis）样品。样品来源涵盖中国多个省份，其中百合样本来自甘肃、湖南等主要产区，银耳样本来自福建等主要产区，并按比例加权以反映主要市场份额。

研究结果部分首先进行了化合物鉴定与峰选择。研究确定了DTNP与亚硫酸根离子在缓冲条件下通过硫醇-二硫化物交换反应形成RSSO₃^-衍生物和相应的硫醇（RS^-）的反应机制。典型色谱图显示，衍生化后在320 nm检测下，亚硫酸盐衍生物在约8.94分钟和9.46分钟处呈现两个明显的色谱峰。高分辨质谱（HRMS）分析证实，8.94分钟的较早洗脱峰对应RS^-（m/z 155），而9.46分钟的后续峰鉴定为RSSO₃^-（m/z 235）。由于RSSO₃^-具有良好线性且结构上与磺化产物相关，研究人员将其选为后续百合和银耳样品分析的定量峰。此外，过滤膜兼容性评估显示，聚四氟乙烯（PTFE）膜产生的峰面积始终高于尼龙膜，因为尼龙膜可能通过酰胺官能团的氢键吸附芳香族酸性化合物，因此本研究选用PTFE膜进行后续测定。

在方法选择性和基质效应评估方面，研究人员比较了不同波长下的色谱图。在213 nm下，观察到严重的基质干扰和复杂基线，而将检测波长调整至320 nm显著降低了这些干扰，提供了清洁的基线和强大的信号响应。未衍生化的亚硫酸盐标准品在320 nm下无检测峰，证实了吸收和保留时间的变化依赖于衍生化反应。针对百合和高多糖银耳基质，1% (v/v) 正丙醇水溶液在25 °C下辅助超声提取，有效提取了亚硫酸盐，减少了氧化降解，同时防止了百合中淀粉的糊化，并结合320 nm检测（大多数多糖在此波长下缺乏紫外吸收），大幅减少了基质干扰。基质效应评估显示，百合和银耳的基质效应百分比（ME%）均在±10%以内，表明整合方法有效中和了潜在干扰，适用于外部溶剂基校准。

方法验证结果显示，在干蔬菜样品中，LOD和LOQ分别为0.0039 g/kg和0.013 g/kg，远低于中国国家标准MRL（0.2 g/kg）。精密度分析中，除银耳基质低浓度水平下的一次日间RSD为14.30%外，所有RSD值均低于10%，表明方法具有良好的重复性和中间精密度。回收率分析表明，百合和银耳样品在低、中、高三个加标水平的平均回收率分别为92.62%、93.66%、95.80%和95.72%、98.04%、100.26%，整体回收率在79.17%–115.04%之间，大多数值落在80-110%的可接受范围内，证明了方法的准确度。稳健性分析显示，在衍生化时间、缓冲液pH值、DTNP浓度、流动相浓度和柱温的微小变化下，峰面积和保留时间的RSD均低于2%，证实方法稳健。

对19个市售干蔬菜样品的总SO₂残留量调查表明，所有银耳样品的SO₂残留量均符合MRL。在10个百合样品中，9个符合MRL，而一个来自甘肃省的百合样品（Lily Bulb-Gansu-2）总残留量高达4.05 g/kg，超出MRL约20倍。通过与官方MW蒸馏法的比较，发现对于银耳样品，两种方法结果一致；但对于百合样品，DTNP-HPLC法测得的相对偏差较大。研究认为，MW法中的强酸消化和高温蒸馏可能触发淀粉糊化，形成粘性胶体基质，物理包裹结合态亚硫酸盐，阻碍其完全释放，从而导致高淀粉基质中SO₂残留量的低估。这表明DTNP-HPLC法在高温敏感的高淀粉基质中可能提供更优的回收率。

膳食暴露与健康风险评估显示，基于平均残留浓度（709.95 mg/kg），成人平均暴露场景下的危害商（HQ）为0.172，低于1的阈值，表明总体慢性膳食风险较低。然而，基于最高检测浓度（4050 mg/kg）的高暴露场景下，成人HQ为0.984，接近参考剂量阈值。由于儿童体重较低，其实际风险可能更高，提示食用极端残留水平产品的敏感人群可能面临增高的慢性膳食风险。

综上所述，本研究应用并验证了柱前DTNP衍生化HPLC法用于测定干百合和银耳中的总SO₂残留量。通过将检测波长从213 nm调整至320 nm，该方法显著减轻了复杂干蔬菜基质中与直接紫外检测相关的基质干扰。使用1% (v/v) 正丙醇在环境温度下进行温和的超声辅助提取有助于稳定亚硫酸盐残留，同时最小化淀粉糊化，提供了改善的结合态亚硫酸盐回收率，并为富含淀粉的干蔬菜基质提供了官方MW蒸馏法的补充方法。该方法表现出优异的分析性能，包括高灵敏度、宽线性范围、可接受的回收率以及在操作条件微小变化下的稳健重复性，证实其适用于常规食品安全监测。对19个市售干蔬菜样品的应用识别出一个严重不合格的百合产品，其SO₂残留量超出监管限约20倍。膳食暴露评估表明，成人从这一单一食品类别中暴露的HQ值接近参考剂量阈值，突出了监测干蔬菜中亚硫酸盐残留的重要性。这些发现证明了DTNP-HPLC方法在监管和行业中质量控制方面的实用价值，这一基质适应的分析选项可支持中国和地区干蔬菜的食品安全监测。