为了评估邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP）暴露与成年男性睾酮缺乏之间的关联，并探索与DEHP相关的雄性生殖毒性有关的分子变化及候选化合物，研究人员采用了一种多层整合策略。计算毒理学预测了DEHP的内分泌干扰潜力。在NHANES 2013–2016年成年男性队列中，通过调查加权逻辑回归和限制性立方样条模型，评估了尿液DEHP代谢物与睾酮缺乏之间的关联。雄性Sprague-Dawley大鼠暴露于DEHP以评估性激素、睾丸/附睾组织病理学、氧化应激、炎症及CD68⁺巨噬细胞浸润情况。研究人员整合了不孕症转录组数据，结合集成机器学习算法鉴定核心基因（hub genes），并在睾丸单细胞RNA测序（scRNA-seq）中通过基于虚拟敲除的网络推断进行映射。Connectivity Map筛选结合分子对接和分子动力学模拟优先筛选出候选化合物。结果显示，在NHANES队列中，氧化DEHP代谢物（MEHHP、MEOHP和MECPP）与睾酮缺乏几率增加相关，并显示出单调剂量-反应增加趋势。大鼠实验表明，DEHP导致睾酮水平降低，伴随卵泡刺激素（FSH）/黄体生成素（LH）水平下降，破坏睾丸结构和精子发生，并增加氧化应激、炎症标志物及巨噬细胞浸润。核心基因（NNT、ACSS1、NANOG、S100A16和CELF4）主要参与线粒体能量代谢和氧化还原稳态。Connectivity Map筛选和计算机分析优先将齐墩果酸（ursolic acid）确定为候选化合物，预测的齐墩果酸–ACSS1复合物在分子动力学模拟中显示相对稳定性。结论指出，DEHP暴露与男性睾酮缺乏相关，并在大鼠中诱导生殖毒性。整合分析突出了候选代谢、氧化还原、炎症及支持细胞相关网络改变。齐墩果酸被计算优先列为候选化合物，但需实验验证。
环境内分泌干扰物对雄性生殖健康的威胁日益严峻，全球精子浓度显著下降，其中邻苯二甲酸酯类塑料增塑剂因其普遍存在而备受关注。DEHP作为产量最大、应用最广的邻苯二甲酸酯，其内分泌干扰特性对男性生殖功能的危害已引起国际关注。尽管流行病学研究提示DEHP暴露与男性生殖毒性相关，但其确切的分子机制尚不完全清楚，且缺乏有效的干预策略。鉴于此，研究人员旨在通过多层整合策略，结合人群关联分析、动物实验、多组学数据挖掘和机器学习，阐明DEHP相关雄性生殖毒性的分子变化，并寻找潜在干预化合物。
研究人员主要采用的技术方法包括：利用NHANES 2013–2016成年男性数据进行流行病学关联分析；建立雄性Sprague-Dawley大鼠DEHP暴露模型（剂量基于人体暴露上限估算及体表面积换算，设10、100、1000 mg/kg/d三个剂量组，分30d和60d两个时间点）；从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库获取GSE6872和GSE160749男性不育转录组数据集，以及GSE149512睾丸单细胞转录组数据；应用ProTox 3.0和ADMETlab 2.0进行计算毒理学预测；采用集成机器学习算法（LASSO、SVM-RFE等）筛选核心基因；利用scTenifoldKnk进行单细胞虚拟敲除网络推断；通过Connectivity Map (CMap)及TCMSP、HERB数据库进行候选化合物筛选，并结合分子对接与分子动力学模拟评估结合稳定性。
研究结果方面，3.1节DEHP毒性预测与人群证据显示，计算毒理学预测DEHP具有内分泌干扰特性。在NHANES人群中，氧化DEHP代谢物（MEHHP、MEOHP、MECPP）与成年男性睾酮缺乏显著相关，且呈现单调的线性剂量-反应关系，支持这些代谢物作为与雄激素状态相关的暴露标志物。3.2节DEHP暴露诱导大鼠内分泌紊乱及睾丸-附睾损伤表明，DEHP暴露导致大鼠血清睾酮、FSH、LH水平下降，精子活力和浓度降低，睾丸和附睾组织出现进行性病理损伤，包括生精小管结构紊乱、血睾屏障破坏及线粒体超微结构损伤，且呈剂量和时间依赖性。3.3节至3.5节核心基因筛选与功能富集分析发现，通过整合DEHP相关基因与男性不育转录组数据，利用机器学习筛选出NNT、ACSS1、NANOG、S100A16和CELF4五个核心基因。功能分析显示这些基因主要富集于线粒体能量代谢、氧化还原稳态及免疫调节。动物实验验证了DEHP暴露引起氧化应激指标（MDA升高，T-SOD、T-AOC降低）和炎症因子（TNF-α、IL-1β升高）增加，伴随CD68⁺巨噬细胞浸润，证实核心基因参与“能量代谢-氧化应激-炎症/免疫”网络调控。3.6节单细胞分辨率下核心基因表达谱及虚拟敲除技术显示，单细胞测序证实核心基因在支持细胞（Sertoli cells）中表达。基于S100A16的虚拟敲除分析推断其可能调控支持细胞内的线粒体能量代谢和核糖体相关基因网络，提示DEHP通过过度激活S100A16导致支持细胞代谢支持能力受损。3.7节基于CMap筛选的齐墩果酸作为候选化合物，分子对接和动力学模拟预测齐墩果酸与核心基因编码蛋白（尤其是ACSS1）具有良好的结合稳定性，提示其具有潜在保护作用。
讨论部分指出，DEHP暴露导致的睾酮缺乏是内分泌干扰向组织损伤转变的关键节点。DEHP可能通过抑制ACSS1和NNT，破坏线粒体乙酰-CoA供应和NADPH生成，导致能量供应不足和氧化防御崩溃，形成恶性循环。S100A16的异常上调可能通过支持细胞网络抑制下游线粒体呼吸链和核糖体基因，将适应性反应转化为病理损伤。氧化应激与炎症反应互为正反馈，加剧生殖损伤。齐墩果酸通过调节氧化应激和炎症显示出潜力，但其与ACSS1的结合及S100A16靶向作用需实验验证。研究结论为DEHP相关的雄性生殖毒性提供了多层面证据，强调了线粒体能量代谢和氧化还原失衡的核心作用，但因果通路及齐墩果酸的疗效仍需进一步实验验证。
