靶向叶酸受体α的双特异性嵌合体降解技术(FolTAC-dual)实现协同膜蛋白降解并克服癌症耐药性

癌症耐药性严重制约靶向治疗疗效，常由膜受体交叉对话引发。本研究开发了叶酸受体α靶向嵌合体(FolTAC-dual)平台，通过“线型”构象设计同步降解EGFR/HER2或PD-L1/VISTA受体对，结合亲和力提升85%，在耐药乳腺癌模型和免疫耐药模型中均展示卓越治疗效果，为临床转化提供新策略。

癌症药物耐药性已成为肿瘤治疗领域的重要挑战，其背后机制往往涉及膜结合受体之间复杂的交叉对话，从而导致单一靶向治疗策略失效。例如，针对HER2阳性乳腺癌的曲妥珠单抗(Trastuzumab)治疗常因EGFR或HER3信号通路上调而产生耐药；而在免疫治疗领域，PD-L1阻断疗法也常因VISTA等替代性免疫检查点的补偿作用而失效。这些机制凸显了开发能够同时靶向多个膜受体、且能从根本上消除而非仅仅抑制靶蛋白的创新治疗平台的迫切性。

近年来，靶向膜蛋白降解技术如LYTACs（溶酶体靶向嵌合体）的出现为这一领域带来了新思路。然而，现有技术仍存在局限性，包括难以实现多靶点同步降解、靶标适应性有限等。叶酸受体α（FRα）因其高效的内吞特性、在多种癌症中的高表达以及已被FDA批准的安全性记录，成为一个极具吸引力的靶向载体。基于此，研究人员开发了新型双膜受体降解策略——叶酸受体α靶向嵌合体双靶向系统（Folate Receptor α Targeting Chimeras-dual, FolTAC-dual），旨在通过理性化模块设计实现两种不同膜受体的同步降解。

该研究通过系统优化结合配体、连接子和几何构型，发现“线型”（string）构象相比传统的“杵臼式”（knob-into-hole）设计能显著提高降解效率。机制研究表明，线型构象使EGFR结合亲和力提升85%，这可能是其双靶降解性能增强的关键。概念验证研究显示，靶向EGFR/HER2的FolTAC-dual能有效抑制曲妥珠单抗/拉帕替尼（Trastuzumab/Lapatinib）耐药型HER2阳性乳腺癌模型的肿瘤生长；而靶向PD-L1/VISTA的FolTAC-dual则能在PD-L1抗体耐药的同源小鼠模型中重塑免疫应答。这些发现确立了FolTAC-dual作为一个有前景的双降解平台，具备较高的临床转化潜力。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过流式细胞术系统评估FRα在癌细胞与正常细胞中的表达差异；采用蛋白质工程手段构建并优化多种FolTAC变体（包括单靶和双靶降解器）；利用竞争结合实验和Cheng-Prusoff方程计算结合亲和力；建立耐药细胞系（SKBR3 Traz/Lap-resistant）和患者来源类器官（PDO）模型进行药效验证；使用免疫共沉淀和共聚焦显微镜验证三元复合物形成及溶酶体共定位；通过荷瘤小鼠模型（包括异种移植和同源移植模型）进行体内药效和药代动力学评价。

研究结果部分，首先通过理性设计优化了FolTAC的单靶降解能力。比较不同结合配体（如Trastuzumab scFv与HER2 affibody）、连接子（如组织蛋白酶B连接子CatB）和同种型（v0.2, v0.4, v0.5）对降解效率的影响，最终确定采用affibody结合体、省略CatB连接子、使用双结合臂的v0.2同种型作为最优设计。该设计在多种靶点（TfR1、EGFR、HER2、PD-L1、VISTA）均实现高效降解（50–90%），并证实降解过程依赖于溶酶体途径而非蛋白酶体。

在双靶降解器构建中，研究团队设计了两种几何构型——杵臼式（v0.6）和线型（v1.0），并选取了两对具有临床相关性的靶点对：EGFR/HER2（在乳腺癌中协同驱动耐药）和PD-L1/VISTA（在免疫抑制中具有互补作用）。结果表明，线型构型在降解效率和结合亲和力方面均显著优于杵臼式设计。竞争性结合实验显示，线型FolTAC-dual的EGFR结合KD值达0.92 nM，较杵臼式（6.31 nM）提高85%，且双价杵臼式设计仍无法完全弥补几何约束带来的局限性。

机制研究表明，FolTAC通过FRα介导的内吞作用将靶蛋白带入溶酶体降解途径。pHrodo标记实验证实癌细胞对FRα内吞作用显著强于正常细胞；共聚焦成像显示CAR-GFP与晚期内体标志物Rab7和溶酶体标志物LAMP1b共定位；溶酶体抑制剂（氯喹CQ、巴弗洛霉素Baf）可阻断降解，而蛋白酶体抑制剂MG132则无此效果。此外，FRα敲低或竞争性抗体均能抑制FolTAC的降解效能，证实其FRα依赖性。

在治疗应用方面，靶向EGFR/HER2的FolTAC-dual v1.0在曲妥珠单抗/拉帕替尼耐药SKBR3模型中表现出强效抗增殖活性（IC₅₀ 10–20 nM），且对正常细胞毒性较低。共培养实验证实其选择性杀伤癌细胞而非正常成纤维细胞。下游信号分析显示，该降解器能同时抑制p-AKT T308和S473位点磷酸化，阻断HER2-AKT生存通路。体内实验显示，FolTAC-dual v1.0处理的小鼠肿瘤生长显著抑制，且药代动力学特征良好（半衰期约6天）。患者来源类器官（PDO）实验进一步验证其降解效能和增殖抑制效果。

针对免疫治疗方向，研究还构建了靶向PD-L1/VISTA的FolTAC-dual v1.0（采用小鼠IgG2A变体用于同源模型）。在MC38同源小鼠模型中，该降解器能实现＞60%的靶蛋白降解，并显著抑制肿瘤生长、提高生存率，凸显其调节肿瘤微环境（TME）的潜力。

研究结论与讨论部分强调，FolTAC-dual平台通过协同降解两种膜受体，为解决癌症耐药性和免疫抵抗提供了创新策略。其线型几何设计带来的结合亲和力提升和高效内吞能力是性能优化的关键。然而，研究也指出潜在局限性：肿瘤可能通过替代通路（如MET或IGF-1R）产生新耐药；降解可能导致新抗原丢失影响免疫识别；当前模型尚未完全覆盖临床耐药异质性。未来研究需探索联合治疗策略（如与CTLA-4抑制剂联用）、优化降解器设计以保留免疫原性、并在更广泛模型中进行验证。总之，该研究不仅为双靶向降解器开发提供了概念验证和设计范式，也为其在妇科癌、乳腺癌及免疫治疗领域的临床应用奠定了坚实基础。

该论文发表于《Nature Communications》，展示了靶向蛋白降解领域的前沿进展，为克服癌症治疗耐药难题提供了强有力的新工具。