利用左旋DNA实现高效多重单蛋白分辨率成像的新策略

本研究针对多重超分辨成像技术依赖二级标记、流程复杂的问题，开发了结合速度优化的右旋与左旋DNA-PAINT序列的简化方案，实现了12重快速高效成像。该技术成功绘制了神经元互作组的三维单蛋白分辨率图谱，空间分辨率达15 nm，为空间蛋白质组学研究提供了强大工具。

在生命科学领域，理解细胞精细分子结构具有根本性意义，因为任何宏观生物现象都源于纳米尺度的特定分子相互作用和排列。虽然成像质谱流式(IMC)、多重离子束成像(MIBI)和共检测索引(CODEX)等技术在揭示亚细胞异质性方面取得重要进展，但其空间分辨率局限在200 nm左右，无法研究分子尺度的蛋白质相互作用。

超分辨显微镜虽能实现分子级分辨率，但由于荧光蛋白和有机染料可区分发射波长有限，多重成像通常仅限于少数蛋白种类。Exchange-PAINT、DNA-PRISM和maS3TORM等方法能将多重性扩展到10个以上"通道"，但受限于长采集时间。最近开发的FLASH-PAINT和SUM-PAINT方法通过结合速度优化的DNA-PAINT读出链与初级DNA条形码和次级标记探针，实现了理论上无限多重性和高达100倍的速度提升，但这些方法需要复杂的实验优化，依赖于不稳定或瞬态次级DNA条形码，需要额外的杂交和信号灭活步骤，或涉及复杂的链置换动力学，这些复杂性给常规应用特别是非专家用户带来了显著障碍。

另一方面，左旋DNA-PAINT(L-DNA-PAINT)被提出用于增强核环境成像，通过最小化非特异性相互作用来降低背景信号。虽然L-DNA-PAINT实现了与常规(右旋)DNA-PAINT相当的序列特异性和空间分辨率，但其在高通量和多重成像方面的潜力尚未探索。

慕尼黑路德维希马克西米利安大学和马克斯普朗克生物化学研究所的研究团队在《Nature Communications》发表了题为"Left-handed DNA for efficient highly multiplexed imaging at single-protein resolution"的研究论文，介绍了一种结合速度优化的右旋和左旋DNA-PAINT序列的改进高通量超分辨多重成像方法。

研究人员利用右旋速度优化序列(R1-R6)的概念，设计了由镜像碱基对合成的无发夹结构的左旋类似物(L1-L6)，从而能够直接组合右旋和左旋DNA序列，获得最多12个靶标的速度优化多重成像库。这个新库可以直接用于简单的Exchange-PAINT工作流程，无需次级DNA标记。

主要技术方法包括：使用左旋和右旋DNA-PAINT序列进行多重成像；通过DNA折纸结构评估序列性能；在U2OS细胞中进行亚5 nm分辨率成像；在原代大鼠海马神经元中进行13重成像；使用单分子定位显微镜进行数据采集和重建。

Characterization of speed-optimized left-handed DNA-PAINT

研究人员设计了具有正交右旋或左旋DNA结合位点的DNA折纸结构，间距15 nm。使用12轮右旋和左旋Exchange-PAINT成像，确认序列间无串扰，15 nm间距的单一位点清晰可辨。在5 nm DNA折纸成像中，L1序列清晰分辨5 nm位点，定位精度约1.4 nm。

在合成纳米结构验证后，评估了L-DNA链在细胞环境中的性能。选择U2OS细胞中三个不同的亚细胞靶标：核孔蛋白Nup96-GFP、线粒体外膜蛋白Tom20和微管蛋白α-Tubulin。对所有三个基准靶标实现了亚5 nm定位精度的3D成像，能够区分间距约13 nm的单个Nup96拷贝，分辨线粒体外膜中的单个Tom20蛋白，并可视化单个微管 filaments(由于标记策略的连接，直径约30 nm)。

评估扩展速度优化的L-DNA序列与右旋对应物的结合动力学，结果显示12重成像动力学与先前报道的值相当。虽然在DNA折纸和核孔复合体(NPC)实验以及左旋和右旋序列之间存在某些结合动力学变化，但这些差异可能归因于实验设置的差异。

Revealing a 13-plex neuronal atlas at single protein resolution

在基准测试左旋速度序列后，研究人员将其与右旋对应物结合应用，可视化复杂密集神经元互作组的详细图谱。利用右旋和左旋速度优化库改进的吞吐量，能够在短短10小时内(每100×100 μm²视野2.5小时)以约12 nm空间分辨率(约5 nm定位精度)成像13重(12重Exchange-PAINT加使用Lifeact的肌动蛋白成像)、200×200 μm² 3D超分辨图谱。 comparable的实验使用常规Exchange-PAINT将需要超过一个月才能完成。

这种多尺度空间蛋白质组学实验能够可视化跨越多个神经元及其突触的互作图谱，下至13个不同靶标的单个蛋白质，有效 bridging了神经元间网络和单个突触分子结构之间的差距。

研究展示了整个200×200 μm²视野概览以及所有13个 individual蛋白质靶标及其 respective定位精度。调查这个神经元图谱使研究人员能够以单蛋白分辨率检测兴奋性和抑制性突触及其支架蛋白bassoon、PSD95(兴奋性)和Gephyrin(抑制性)，以及它们 respective神经递质转运蛋白VGlut1(兴奋性)和VGAT(抑制性)。在超分辨神经元图谱中，还发现了最近报道的混合型突触，具有Gephyrin突触后支架和VGlut1神经递质转运蛋白。

此外，生成了关键细胞器(包括线粒体、过氧化物酶体和 Golgi apparatus)的单蛋白分辨率空间图谱。这些图谱揭示了过氧化物酶体(Pmp70)和Golgi(Golga5)之间可能的接触位点，这些接触位点可能代表膜接触位点， enabling直接脂质或蛋白质交换，表明这些细胞器之间存在 previously未被充分认识的串扰。

3D渲染展示了细胞骨架和细胞器蛋白质分布，突出了βII-spectrin环状结构、神经纤维纤维，以及穿越轴突和树突的具有不同形态的线粒体。

研究结论表明，通过结合速度优化的右旋和左旋DNA-PAINT序列，引入了改进的高通量超分辨多重成像方法，允许至今最快的DNA-PAINT多重成像，最多12个靶标。该方法可与肽-PAINT等方法结合，进一步扩展多重性。

通过利用扩展的序列空间、加速的成像动力学和简单的实验设计，在短短10小时内实现了高度多重化的细胞互作图谱，捕获200×200 μm²视野，同时分辨仅10 nm间距的单个蛋白质。这种跨越四个数量级的空间覆盖使能够同时研究分子和网络级特征。该方法将传统上需要长达一个月的成像压缩到单个工作日，为跨复杂多神经元系统的突触结构和可塑性高通量研究开辟了新途径。

研究人员能够 mapping相邻神经元之间的互作模式，追溯轴突连接，并解析每个 engaged突触的囊泡池中的 individual分子组成。同时可视化复杂神经元网络及其互作点的分子组成代表了研究健康和疾病中详细细胞结构的强大方法。通过 enabling许多 individual神经元及其分子内容的视觉比较分析，该方法允许以高通量方式识别结构和分子改变。这些见解可以增进对疾病机制的理解，并 enable开发新颖更精确的治疗方法。最后，该技术不限于探索神经元靶标：方法可扩展到任何可获得初级亲和试剂的生物系统， enabling任何细胞系统的单蛋白水平跨尺度空间蛋白质组学。