环状RNA circLNF通过抑制TRIM25介导的IGF2BP蛋白降解促进食管鳞癌进展

本刊推荐：为解决食管鳞癌(ESCC)中环状RNA(circRNA)功能机制不明的问题，研究人员开展了circLNF在ESCC中作用机制的主题研究。发现circLNF通过"CAUC" motif直接结合IGF2BP家族蛋白，抑制TRIM25介导的泛素化降解，从而稳定IGF2BP蛋白并促进ESCC进展。该研究揭示了circRNA调控蛋白稳定性的新机制，为ESCC治疗提供了潜在靶点。

食管鳞状细胞癌(ESCC)是中国最常见的食管癌类型，占所有病例的约90%，但其五年生存率仍低于13%，是一种高度侵袭性的恶性肿瘤。尽管在多模式治疗方面取得了进展，但驱动肿瘤进展的潜在机制仍知之甚少，迫切需要阐明ESCC的分子决定因素并制定有效的治疗策略。

环状RNA(circRNA)是一类共价闭合的单链RNA，由于其抗外切酶介导的降解能力，比其线性对应物表现出更高的稳定性。越来越多的研究表明，circRNA在多种癌症类型中广泛失调，通过不同的分子机制在调节关键的致癌过程中发挥关键作用，包括持续的增殖信号、转移进展和治疗抵抗。虽然先前的研究已经建立了ESCC中全面的circRNA表达谱，但只有有限的一部分circRNA经过了功能验证。

在这项发表于《Molecular Cancer》的研究中，研究人员通过全面的circRNA分析，发现了一个来自长链非编码RNA EIRRE基因的先前未表征的circRNA——circLNF，在ESCC肿瘤中显著上调。功能表征通过基因敲低和过表达证明，circLNF在体外显著增强细胞增殖和迁移，在体内加速肿瘤生长和转移。机制上，circLNF通过保守的"CAUC" motif直接与IGF2BP家族蛋白相互作用，从而通过阻止TRIM25介导的泛素化和随后的蛋白酶体降解来稳定这些癌蛋白。这种调节轴通过ESCC标本中circLNF表达与IGF2BP1蛋白水平之间的强正相关性得到了临床验证。

研究人员运用了多项关键技术方法：通过RT-PCR、Sanger测序和荧光原位杂交(FISH)表征circRNA；利用RNA pull-down结合质谱分析、电泳迁移率变动分析(EMSA)、共免疫沉淀(Co-IP)和免疫印迹分析研究分子相互作用；通过体外和体内的功能获得和功能丧失研究评估circRNA功能；使用来自西华医院和商业来源的ESCC患者标本进行临床相关性评估。

circLNF在ESCC肿瘤中显著上调

通过Ribo-Zero RNA测序和RT-qPCR验证，发现circLNF在ESCC肿瘤中显著上调，其高表达与淋巴结转移和不良预后相关。

circLNF的分子特征

实验验证了circLNF的环状结构，证明其对RNase R具有抗性，比线性转录本更稳定，且主要定位于细胞质中。

circLNF过表达促进肿瘤生长和转移

在KYSE30和KYSE150细胞中过表达circLNF，显著增强了细胞增殖、迁移和侵袭能力，在动物模型中促进了肿瘤生长和肺转移。

circLNF敲低抑制ESCC恶性进展

在ECA109和KYSE410细胞中敲低circLNF，抑制了细胞增殖、迁移和侵袭，在体内实验中减少了肿瘤生长和肺转移负担。

circLNF与IGF2BP家族蛋白物理相互作用

RNA pull-down和质谱分析发现circLNF与IGF2BP家族蛋白相互作用，RIP实验进一步验证了这种相互作用。

circLNF通过"CAUC" motif与IGF2BP相互作用

生物信息学分析确定了circLNF中的五个潜在IGF2BP结合位点，实验证实p1和p2探针(含"CAUC" motif)能特异性结合IGF2BP蛋白，突变这些motif后结合消失。

circLNF/IGF2BP相互作用有助于ESCC进展

与野生型circLNF相比，"CAUC"突变体circLNF失去了促进细胞增殖、迁移和肿瘤生长及转移的能力，表明circLNF的致癌功能依赖于与IGF2BP的相互作用。

circLNF通过抑制泛素-蛋白酶体降解稳定IGF2BP蛋白

circLNF过表达增加了IGF2BP蛋白水平，而敲低则降低了其表达。cycloheximide追踪实验显示circLNF延长了IGF2BP蛋白的半衰期，MG132处理可逆转circLNF敲低引起的IGF2BP减少。泛化化实验表明circLNF减少了IGF2BP的多泛素化。

circLNF竞争性抑制TRIM25介导的IGF2BP蛋白降解

TRIM25过表达降低了IGF2BP蛋白水平，而敲低则增加了其表达。Co-IP实验证实了TRIM25与IGF2BP之间的相互作用。circLNF过表达减少了TRIM25-IGF2BP复合物的形成，而不影响TRIM25的表达水平。

circLNF与IGF2BP1蛋白表达的临床相关性

免疫组织化学分析显示，在ESCC组织微阵列中，circLNF表达与IGF2BP1蛋白水平呈正相关，支持了circLNF-IGF2BP调控轴的病理意义。

研究结论和讨论部分强调，这项研究确定了circLNF作为ESCC中显著上调的circRNA，其作为强有力的预后生物标志物，高表达与不良临床结果密切相关。通过全面的功能获得和功能丧失研究，证明circLNF在体外促进ESCC细胞增殖和迁移，在体内加速肿瘤生长和转移。机制上，circLNF通过特定的"CAUC" motif直接与IGF2BP蛋白相互作用，从而竞争性抑制TRIM25介导的泛素化和随后的蛋白酶体降解。ESCC患者标本中circLNF表达与IGF2BP1蛋白水平之间的显著正相关性进一步验证了这种调控轴的临床相关性。

这些发现建立了一个新的分子机制，即circLNF通过稳定IGF2BP癌蛋白驱动ESCC进展，突出了其作为ESCC诊断标志物和治疗靶点的潜力。该研究不仅增进了对circRNA在癌症中功能机制的理解，而且为ESCC的治疗干预提供了新的策略。