心肌细胞USP20通过去泛素化抑制NLRP3活性缓解脓毒症心肌病

本文揭示了脓毒症心肌病（Septic Cardiomyopathy）的新机制：心肌细胞特异性去泛素化酶USP20通过靶向NLRP3炎症小体，特异性去除其K243位点的K63连接泛素化修饰，抑制NLRP3-ASC相互作用及炎症小体活化，从而减轻细胞焦亡（Pyroptosis）和心肌损伤。该研究为脓毒症心肌功能障碍提供了新的治疗靶点和基因治疗（AAV9介导的USP20过表达）策略。

1 引言

脓毒症心肌病是脓毒症常见且严重的并发症，显著影响患者预后，其特征为左心室收缩功能障碍，发生率达20%-60%，伴有较高死亡率。其病理机制复杂，目前缺乏有效治疗手段。蛋白质泛素化作为一种重要的翻译后修饰，参与调控蛋白降解和活性，维持生理过程平衡。去泛素化酶（DUBs）通过去除底物蛋白的泛素修饰，在多种疾病中发挥关键作用。近年研究发现DUBs参与脓毒症发病过程，如USP7通过增强NLRP3表达加重脓毒症心肌损伤。本研究聚焦去泛素化酶USP20在脓毒症心肌病中的作用机制。

2 材料与方法

研究使用心肌细胞特异性USP20基因敲除（USP20CKO）和NLRP3基因敲除（NLRP3^-/-）小鼠，通过脂多糖（LPS）腹腔注射和盲肠结扎穿孔（CLP）建立脓毒症模型。采用重组腺相关病毒血清型9（AAV9）实现心肌特异性USP20过表达。通过超声心动图评估心功能，组织病理学染色和TUNEL检测分析心肌损伤和细胞死亡，Western blot、免疫共沉淀（Co-IP）及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析分子机制。体外实验使用新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和HL-1细胞系，通过LPS/尼日利亚菌素（Nig）刺激模拟脓毒症损伤。

3 结果

3.1 USP20是脓毒症心肌病的关键参与者

通过GEO数据库分析和实验验证，发现USP20在脓毒症小鼠心肌组织中mRNA和蛋白水平均显著下调。单细胞测序和免疫荧光染色证实USP20主要表达于心肌细胞，且在LPS/Nig刺激的心肌细胞中特异性下调。功能实验表明，过表达USP20减轻LPS/Nig诱导的心肌细胞损伤，而敲低USP20则加重损伤。

3.2 心肌细胞特异性USP20缺失加重LPS诱导的心肌损伤和功能障碍

USP20CKO小鼠经LPS处理后，生存率显著降低，心功能指标射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）进一步下降，血清心肌损伤标志物（cTnI、CK-MB、LDH）和炎症因子（IL-1β、IL-18）水平升高，心肌组织TUNEL和H&E染色显示细胞死亡和组织结构紊乱加剧。

3.3 USP20缺失加重CLP诱导的心肌损伤

在CLP模型中，USP20缺失同样导致生存率下降、心功能恶化、心肌损伤标志物和炎症因子升高，证实USP20在脓毒症心肌病中的保护作用。

3.4 NLRP3是USP20的底物蛋白

通过LC-MS/MS和Co-IP筛选，发现NLRP3与USP20直接相互作用。结构域分析表明USP20通过其USP结构域与NLRP3结合。

3.5 USP20通过调控NLRP3活性影响脓毒症心肌病

USP20过表达并不改变NLRP3总蛋白水平，但显著抑制LPS/Nig诱导的NLRP3与ASC相互作用、ASC斑点形成和寡聚化，减少炎症因子IL-1β释放和细胞焦亡相关蛋白（Caspase-1、GSDMD-NT）表达。USP20缺失则产生相反效应。

3.6 USP20通过活性位点C154去除NLRP3 K243位的K63连接泛素化

USP20特异性去除NLRP3的K63连接泛素链，且该过程依赖其活性位点C154（而非H645）。点突变实验证实NLRP3 K243位点是USP20去泛素化的关键位点。K243R突变体泛素化水平降低，且USP20过表达不再进一步减轻细胞损伤或抑制炎症小体活化。

3.7 过表达USP20改善LPS诱导的脓毒症心肌病

心肌特异性过表达USP20（AAV9-cTnT-USP20^oe）改善LPS小鼠生存率、心功能、心肌损伤标志物和炎症因子水平，减轻心肌细胞焦亡和组织病理损伤，且对肝肾功能和脂代谢无显著影响，表明治疗安全性。

3.8 USP20的保护作用依赖NLRP3

在NLRP3^-/-小鼠中，USP20过表达不再产生保护效应，心功能、生存率、损伤标志物及炎症水平均无显著改善，证实USP20通过靶向NLRP3发挥功能。

4 讨论

本研究首次揭示USP20在脓毒症心肌病中的关键保护作用：心肌细胞USP20通过去泛素化酶活性，直接作用于NLRP3蛋白，去除其K243位点的K63连接泛素链，抑制NLRP3-ASC复合物形成及炎症小体活化，进而减轻细胞焦亡和心肌损伤。USP20下调可能是脓毒症心肌损伤的重要机制之一，而其心肌特异性过表达则提供了潜在治疗策略。尽管AAV9介导的基因治疗面临挑战，本研究为脓毒症心肌病的精准干预提供了新靶点和实验依据。