结肠衰老的时空动态图谱：cSplotch多模态框架揭示细胞与分子梯度

本研究针对结肠组织在衰老过程中空间分子特征不明确的问题，通过构建包含1,500个小鼠肠道组织的空间转录组和40万个单核RNA测序图谱，开发了cSplotch计算框架，首次系统揭示了结肠三个解剖区域和11个年龄组的细胞组成与基因表达梯度，为理解衰老相关肠道病理提供了重要参考。

随着全球人口老龄化加剧，结肠功能衰退已成为影响老年人生活质量的重要健康问题。结肠作为消化系统的重要组成部分，其组织结构和分子回路会受到全身性衰老效应的深刻影响，然而许多潜在的分子机制仍不清楚。传统的单细胞测序技术虽然能够识别细胞类型，却无法保留细胞在组织中的原始空间位置信息；而现有的空间转录组分析方法大多局限于单个组织切片，缺乏整合多样本、多条件数据的计算框架。这种技术局限阻碍了我们对结肠这种大型器官在解剖区域、隐窝轴向和时间维度上功能变化的理解。

针对这一难题，由Aidan C. Daly和Francesco Cambuli等研究人员在《Nature Biotechnology》上发表了题为"Tissue and cellular spatiotemporal dynamics in colon aging"的研究论文。该研究构建了迄今为止最全面的结肠时空图谱，结合空间转录组(ST)和单核RNA测序(snRNA-seq)技术，分析了从近端到远端三个解剖区域、11个年龄组的小鼠结肠样本，并开发了创新的计算工具cSplotch，为研究大型器官的空间组织模式设立了新标准。

研究人员采用的主要技术方法包括：空间转录组(ST)技术用于获取组织原位基因表达信息，单核RNA测序(snRNA-seq)用于高分辨率细胞分型，cSplotch分层贝叶斯模型整合组织学特征和多组学数据，形态学约束的非负矩阵分解(NMF)进行细胞类型反卷积，以及多细胞程序(MCP)分析揭示细胞间协调表达模式。研究样本来源于C57BL/6J小鼠结肠组织，时间跨度从出生到2岁龄，涵盖雄性和雌性个体。

结肠的时空图谱构建

研究团队收集了从小鼠出生到老年(2岁)的结肠标本，涵盖幼年期(<4周)、成年期(6-12周)和衰老期(6个月-2年)三个主要生命周期阶段。空间转录组分支包含约1,500个切片，66,500个空间条形码斑点，每个斑点定量分析12,976个基因的表达。单细胞核分支整合了新生成和公开数据，总计约40万个snRNA-seq谱，被划分为17个主要细胞亚群，包括上皮细胞、免疫细胞、基质细胞等。这种大规模多模态数据为系统研究结肠衰老提供了坚实基础。

cSplotch推断细胞类型组成和基因表达

为解决多样本整合分析难题，研究人员开发了cSplotch分层贝叶斯概率模型。该模型首先利用组织学特征推断每个空间斑点的细胞组成，然后基于反卷积的细胞类型组成推断每个细胞类型中每个基因的MROI特异性和协变量特异性表达率。cSplotch采用两级组织学注释模式，其中形态学区域兴趣点(MROI)如隐窝顶端和隐窝基部，进一步用细胞级形态学数据标记。验证表明，cSplotch的表达估计与TPM标准化值高度相关，并能准确恢复空间差异表达模式，其性能优于SpatialDE2和Spark-X等现有方法。

βˉ)),x axis),region and location(e;mean(exp((\overline{\beta+\psi})),x axis) or all components of the cSplotch model(f;mean λˉ,xaxis). Bottom right, Pearson's r.g-i, IF validation of spatial gene expression trends predicted by cSplotch.g,IF of four gene'>

沿近端-远端结肠轴的细胞组成和细胞类型特异性表达

成年小鼠结肠分析显示，细胞丰度在从近端到远端结肠的过渡中呈现广泛变异。在跨黏膜(CM)区域，杯状细胞比例从近端到远端结肠段下降，而肠道干细胞(ISC)比例向远端增加。在肌层内部和外部(MEI)区域，平滑肌细胞(SMC)丰度向远端下降，而成纤维细胞、淋巴管细胞、巨噬细胞和血管细胞频率增加。细胞类型特异性表达分析发现，近端结肠杯状细胞上调抗菌基因Sprr2b和Sprr2a3，而远端结肠上调关键凝胶形成黏蛋白Muc2。ISC在近端结肠表达更高水平的经典Wnt抑制剂(如Sfrp1)和非经典通路介质(如Ror1和Wnt4)。

沿隐窝轴的细胞类型和基因表达梯度

对隐窝基部到顶端的分析揭示了细胞类型特异性分布模式。ISC、TA和循环TA的比例从隐窝基部到顶端逐渐减少，杯状细胞比例呈现相反梯度，结肠细胞丰度在顶端急剧达到峰值。分子水平上，321个基因在隐窝轴上有显著的单调变异，与特定细胞类型在给定空间生态位中显著相关。隐窝基部上调的基因在ISC中表达，涉及关键生物合成通路，包括DNA复制和修复、蛋白质合成以及转录、翻译和后翻译调控。隐窝顶端上调的基因与杯状细胞顶极极性域的建立相关，包括细胞骨架、细胞间粘附和跨膜运输基因。

结肠衰老过程中细胞类型丰度的时空变异性

衰老过程中，杯状细胞频率从年轻成年(12周)到老年(2岁)动物在中间结肠隐窝轴的所有MROI中下降，在远端结肠的隐窝下区、隐窝基部和隐窝中部区域下降，在近端结肠的隐窝基部下降。相反，祖细胞(ISC和TA)频率在老年小鼠(2岁)中间和远端结肠增加。这些时间动态表明祖细胞增殖和分泌分化之间的不平衡，为老年人观察到的缺陷再生功能提供了细胞基础。

与结肠衰老期间多细胞程序活性相关的细胞类型丰度变异

通过多细胞程序(MCP)分析，研究人员发现了几种在衰老窗口期间在至少一个结肠区域具有近乎单调变化的MCP。隐窝下区MCP2的活性在近端和中间结肠1岁龄时显著下降，可能有助于解释隐窝下区区域细胞组成随年龄的显著变化。隐窝基部MCP1程序由ISC、TA和杯状细胞中的基因表达组成，在1岁龄后在近端和中间结肠活性增加。隐窝中部MCP1程序在近端和中间结肠与远端结肠呈现不同的衰老相关活性。隐窝顶端MCP1程序活性在近端和中间结肠下降。

研究结论表明，结肠衰老与杯状细胞的普遍丧失和弥漫性炎症状态的建立相关，这种状态跨越多个细胞和整个结肠的表达程序。在隐窝上部，杯状细胞被顶端结肠细胞逐渐取代或结肠代谢模式的前化可以为常见老年疾病如便秘和营养不良提供分子见解。在隐窝底部，损伤水平增加与持续性炎症相关，伴随肿瘤抑制基因表达丧失、祖细胞区室过度扩张和向胎儿样状态的细胞去分化。这些时间动态与老年人结直肠癌癌前状态发生率升高一致，并为指导预防和诊断策略指明了特定细胞类型和基因。

这项研究不仅提供了对结肠衰老机制的深入理解，还建立了可应用于各种组织系统的模型框架，有助于弥合单细胞和空间转录组研究之间的差距。cSplotch计算框架的创新性在于其能够整合形态学和分子数据，在大型组织队列中进行空间分辨的细胞表达分析，为未来研究组织发育、稳态和疾病中的空间模式设立了新标准。