何川团队开发出超温和的亚硫酸氢盐测序方法

近年来，DNA甲基化已成为疾病早期检测的生物标志物，尤其是在肿瘤学领域。以单碱基分辨率绘制5-甲基胞嘧啶（5mC）图谱对于阐明发育和衰老背后的表观遗传学机制也至关重要。

亚硫酸氢盐测序（BS-seq）是检测5mC的金标准方法，但传统流程存在诸多缺陷，包括DNA严重损伤、转化不完全和处理时间过长等。这些缺陷严重限制了其在低起始量样本和片段化样本（如cfDNA和FFPE样本）中的应用。

近日，芝加哥大学何川教授领导的研究团队开发出一种甲基化检测的新方法。这种名为超温和亚硫酸氢盐测序（UMBS-seq）的方法在保留BS-seq可靠性和高效性的同时，最大限度降低了DNA损伤和背景噪声。

这篇题为“Ultra-mild bisulfite outperforms EM-seq for 5-methylcytosine detection with low input DNA”的论文发表在预印本服务器bioRxiv上。

此前，何川团队还开发出超快速亚硫酸氢盐测序（UBS-seq），该方法可显著缩短反应时间、提高转化效率并降低假阳性率，但DNA降解的问题仍未解决。此外，无需亚硫酸氢盐处理的酶促方法（EM-seq）也应运而生，但仍面临转化不完全、工作流程冗长和试剂成本高等问题。

考虑到亚硫酸氢盐的浓度越高，转化效率越高，研究人员尝试通过提高亚硫酸氢盐的浓度，在超温和条件下实现高效C→U转化，以减少DNA损伤。最终，他们使用了72%的亚硫酸氢铵溶液，在55℃下反应90分钟。

之后，他们将UMBS-seq的性能与传统亚硫酸氢盐方法BS-seq和酶促方法EM-seq进行比较。与BS相比，UMBS处理能显著减少DNA片段化并提高DNA回收率。酶促方案虽能保留DNA完整性，但因步骤较多而导致DNA损失。

在处理不同起始量的DNA（从10 pg到5 ng）时，UMBS-seq均能实现高效转化，转化效率高于99.5%。相比之下，EM-seq在DNA起始量较低时背景信号显著升高。他们还发现，EM-seq容易产生假阳性结果。

为了评估UMBS-seq的临床应用价值，研究人员在游离DNA（cfDNA）上评估了三种方法的性能。UMBS-seq在文库产量、复杂度和转化效率等多个关键指标上均优于BS-seq和EM-seq方法。电泳结果显示，UMBS-seq文库中长片段cfDNA的相对丰度更高，表明其DNA降解程度低于BS-seq。

“UMBS-seq通过最大限度减少DNA损伤并维持胞嘧啶高效转化，实现了亚硫酸氢盐转化技术的重大突破。……与靶向捕获技术相结合，UMBS-seq能够在低起始量的cfDNA中实现5mC生物标志物的灵敏检测，”作者在文中写道。

研究人员认为，UMBS-seq在cfDNA和靶向捕获中的出色表现彰显了其在临床应用领域的巨大潜力，未来有望应用于5mC生物标志物检测和疾病早期诊断。

据介绍，Ellis Bio公司拥有芝加哥大学UMBS技术的全球独家授权，计划在晚些时候以SuperMethyl™ Max试剂盒的形式推出这项技术。SuperMethyl Max拥有简便的两至三小时操作流程，假阳性率降低六倍，并在多个样本类型中实现高产量。