缺氧诱导环状RNA编码蛋白cPFKFB4通过调控PKM2剪接促进胰腺癌代谢重编程的新机制

本研究针对胰腺癌缺氧微环境中葡萄糖代谢重编程的调控机制，发现缺氧诱导的环状RNA hsa_circ_0065394编码新型蛋白cPFKFB4，通过破坏hnRNP G/hnRNP A1复合物增强PKM2选择性剪接，进而强化糖酵解并驱动肿瘤恶性进展。该研究为缺氧微环境与代谢重编程的交叉调控提供了新视角，为胰腺癌治疗提供了潜在靶点。

胰腺癌作为消化系统高度恶性的肿瘤，其五年生存率始终徘徊在10%左右，被称为"癌中之王"。这种严峻的预后与肿瘤特有的缺氧微环境密切相关。在胰腺癌组织中，氧分压可低至0-5.3 mmHg，远低于正常组织的9.3-92.7 mmHg。这种极度缺氧的状态不仅帮助肿瘤细胞适应恶劣环境，还驱动了一系列恶性生物学行为，成为胰腺癌预后不良的独立预测因素。

在缺氧微环境中，环状RNA（circRNA）作为一类新型闭合环状分子，通过反向剪接形成，其生物发生和功能与肿瘤缺氧微环境密切相关。研究表明，缺氧能诱导肿瘤细胞产生多种circRNA，这些分子帮助肿瘤细胞在缺氧条件下维持生存并促进肿瘤进展。然而，在胰腺癌中，缺氧相关circRNA编码的蛋白质功能仍不清楚。

研究人员将目光聚焦于PFKFB4基因——一个在糖代谢中发挥关键作用的酶。PFKFB4作为糖酵解分流酶，在果糖-2,6-二磷酸和果糖-6-磷酸的相互转化中起核心作用，满足肿瘤细胞的能量需求和氧化还原稳态，从而促进肿瘤细胞在缺氧环境中的生存。基于此，研究团队提出科学假设：源自PFKFB4基因的circRNA可能是驱动胰腺癌细胞适应缺氧微环境并持续恶性演进的关键分子。

为验证这一假设，研究人员采用缺氧培养系统筛选胰腺癌中缺氧响应的circRNA，通过生物信息学分析和RNA免疫沉淀研究hsa_circ_0065394的环化机制，利用qRT-PCR和原位杂交评估其在胰腺癌中的表达谱和临床意义。双荧光素酶报告基因检测、质谱分析和Western blotting鉴定出hsa_circ_0065394编码的蛋白cPFKFB4。通过功能获得和缺失实验在体内外验证cPFKFB4的生物学功能。从机制上，通过质谱分析、免疫共沉淀、免疫荧光、PKM剪接检测、RNA免疫沉淀、Western blotting和挽救实验，探索cPFKFB4如何调节hnRNP G与hnRNP A1的相互作用以及PKM选择性剪接的调控。

研究发现缺氧相关的hsa_circ_0065394在胰腺癌组织中显著上调，且与肿瘤大小密切相关。其生物环化由hnRNP L和Alu重复序列介导。机制上，hsa_circ_0065394通过非帽依赖机制编码一个94个氨基酸的蛋白cPFKFB4。cPFKFB4通过特异性结合hnRNP G破坏hnRNP G-hnRNP A1复合物，促进hnRNP A1介导的PKM选择性剪接，从而增加PKM2的表达，进而增强胰腺癌细胞的糖酵解，加速缺氧条件下胰腺癌的增殖和转移。

关键技术方法

研究采用临床样本队列（44对胰腺癌及癌旁组织）和肿瘤组织芯片（70例胰腺癌和58例正常组织），通过缺氧培养系统（1% O₂）模拟肿瘤微环境。利用RNA酶R和放线菌素D实验验证circRNA特性，双荧光素酶报告系统检测IRES活性，质谱分析鉴定蛋白质相互作用，体内外功能实验包括CCK-8、Transwell、裸鼠成瘤等评估生物学表型，PKM剪接实验和代谢检测分析分子机制。

hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌细胞中的鉴定与表征

研究人员首先在缺氧条件下筛选PFKFB4来源的circRNA，发现hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌细胞中表达最显著。Sanger测序证实该circRNA是由PFKFB4基因外显子2、3、4通过头尾剪接形成的281nt环状RNA。

实验证实hsa_circ_0065394对RNA酶R具有抗性，且半衰期长于线性mRNA，在细胞核和细胞质中均有分布，表明其是缺氧胰腺癌细胞中丰富且稳定表达的circRNA。

hsa_circ_0065394的生物发生机制

通过生物信息学分析，研究人员在hsa_circ_0065394侧翼内含子中发现了高反向互补性的Alu重复序列（AluYc和AluSx1）。缺失突变实验证明只有同时存在这两个Alu元件才能显著上调hsa_circ_0065394表达。

进一步筛选发现hnRNP L是hsa_circ_0065394生物发生的关键调控因子。RNA免疫沉淀实验证实hnRNP L结合到PFKFB4前体mRNA的特定位点，促进侧翼内含子互补重复元件的结合，从而加速hsa_circ_0065394的环化。

hsa_circ_0065394的表达特征与临床意义

在胰腺癌细胞系中，hsa_circ_0065394表达显著上调，尤其在PANC-1和PL45细胞中。临床样本分析显示其在胰腺癌组织中明显高表达，且与肿瘤大小显著相关。

组织芯片和原位杂交结果进一步验证了hsa_circ_0065394在胰腺癌组织中的高表达。生存分析显示高表达患者总生存期更差，表明其具有重要的临床预后价值。

hsa_circ_0065394编码新型蛋白cPFKFB4

生物信息学预测发现hsa_circ_0065394包含一个285nt的开放阅读框（ORF）和内部核糖体进入位点（IRES）。实验证实该circRNA可翻译产生约25kDa的蛋白，命名为cPFKFB4。

双荧光素酶报告基因实验证明IRES序列具有启动翻译活性，且完整的IRES序列对cPFKFB4的翻译至关重要。

cPFKFB4通过hnRNP G调控PKM选择性剪接

质谱分析和免疫共沉淀实验发现cPFKFB4与hnRNP G特异性相互作用。进一步实验确定cPFKFB4结合hnRNP G的SRGY和C-RBD结构域。

研究发现hnRNP G通过C-RBD结构域直接结合hnRNP A1，而cPFKFB4通过竞争性结合hnRNP G的C-RBD结构域，破坏hnRNP G-hnRNP A1复合物形成，从而增强hnRNP A1与PKM前体mRNA的结合。

PKM剪接实验表明cPFKFB4上调增加PKM2亚型比例，下调增加PKM1亚型比例，且这一调控依赖于hnRNP G。

cPFKFB4增强胰腺癌细胞糖酵解

代谢检测发现cPFKFB4显著促进乳酸生成、葡萄糖摄取和ATP产生，增强胰腺癌细胞的糖酵解水平。挽救实验证实这一效应通过hnRNP G介导。

cPFKFB4通过PKM2促进胰腺癌恶性进展

体内外实验证实cPFKFB4通过PKM2促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。动物实验显示cPFKFB4对肿瘤生长的促进作用可被PKM2敲低所逆转。

研究结论与意义

该研究首次揭示了缺氧诱导的环状RNA hsa_circ_0065394编码新型蛋白cPFKFB4，通过调控hnRNP G/hnRNP A1复合物影响PKM选择性剪接，进而重编程葡萄糖代谢促进胰腺癌进展的分子机制。

这一发现不仅为理解缺氧微环境、葡萄糖代谢重编程与胰腺癌恶性进展之间的交叉对话提供了新视角，也为胰腺癌的诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。cPFKFB4作为环状RNA编码的新型功能蛋白，拓展了我们对非编码RNA功能多样性的认识，为肿瘤代谢研究开辟了新方向。

该研究发表于《Molecular Cancer》杂志，为胰腺癌的精准治疗提供了新的理论基础和实验依据，对改善胰腺癌患者预后具有重要的临床意义。