血红素结合蛋白hemopexin通过性别特异性调控炎症和铁死亡促进脊髓损伤后功能恢复和组织保护

本研究聚焦脊髓损伤(SCI)后继发性损伤的防治难题，探讨了血红素结合蛋白hemopexin(Hx)的保护作用及机制。研究人员发现，Hx及其受体LRP-1在SCI后显著上调，缺失Hx会恶化小鼠运动功能恢复，并揭示其作用存在性别差异：雌性Hx-/-小鼠表现为中性粒细胞浸润增加和脂质过氧化加剧，而雄性则出现神经元存活率下降和成熟中性粒细胞减少。该研究发表于《Journal of Neuroinflammation》，为开发靶向血红蛋白毒性的性别特异性治疗方案提供了新思路。

当脊髓受到严重创伤时，除了瞬间造成的原发性损伤，更令人担忧的是后续如同多米诺骨牌般接连发生的继发性损伤。其中，损伤区域内的血管破裂导致出血，红细胞裂解释放出的血红蛋白(Hb)及其分解产物血红素(heme)，如同在伤口上撒盐，会引发剧烈的炎症反应和氧化应激，进一步摧毁本已脆弱的神经组织。磁共振成像(MRI)研究已证实，脊髓损伤后出现脑实质出血的患者，其功能恢复远差于未出血者。因此，如何有效清除这些有毒的血源性产物，阻断继发性损伤通路，成为脊髓损伤治疗研究的关键突破口。

在人体循环系统中，两种急性期蛋白——触珠蛋白(Haptoglobin, Hp)和血红素结合蛋白(Hemopexin, Hx)——如同专业的“清道夫”，分别负责结合游离的血红蛋白和血红素，形成无害的复合物后被免疫细胞清除。然而，中枢神经系统(CNS)内这些“清道夫”的本底水平极低，一旦发生出血，其清除能力会迅速饱和，导致毒性物质泛滥。尽管Hx在脑出血模型中被证明具有神经保护作用，但它在脊髓损伤(SCI)这一同样伴有严重出血的病理过程中究竟扮演何种角色，其细胞来源、作用机制以及是否存在性别差异，此前尚不清晰。

为了回答这些问题，由Antje Kroner教授领导的研究团队在《Journal of Neuroinflammation》上发表了一项重要研究。他们利用小鼠胸段(T10/T11)挫伤性脊髓损伤模型，深入探究了Hx在脊髓损伤后的表达规律、细胞定位、功能作用及其性别特异性的保护机制。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：使用 Infinite Horizon 撞击器建立小鼠脊髓挫伤模型；通过Basso小鼠量表(BMS)和水平梯行走测试进行长期（35天）运动功能评估；采用实时定量PCR(Q-PCR)检测脊髓组织中Hx、LRP-1、炎症因子及相关基因的mRNA表达变化；利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析进行细胞定位（Hx, LRP-1）、细胞计数（中性粒细胞、小胶质细胞/巨噬细胞、星形胶质细胞）、组织损伤体积（GFAP染色面积）、神经元存活（NeuN染色）、轴索损伤（SMI-32染色）以及脂质过氧化水平（4HNE染色）的定量分析。所有行为学评估和数据分析均采用盲法进行。

Hx和LRP-1表达在SCI后上调

研究首先发现，在野生型雌性小鼠中，脊髓损伤后Hx的mRNA表达在6小时即显著升高，24小时短暂回落后，从第7天至第42天（实验终点）持续维持在高水平。而其唯一已知受体LRP-1的mRNA则从第7天开始显著上调并持续至第42天。这一时间点与单核来源的巨噬细胞(MDM)浸润高峰相吻合。

Hx和LRP-1在SCI后的CNS细胞中表达

免疫荧光染色显示，在损伤后第5天，Hx蛋白主要由反应性星形胶质细胞（GFAP阳性）表达，而LRP-1受体则主要定位在呈圆形的CD11b阳性的巨噬细胞/小胶质细胞表面。在损伤后1天峰值期，未检测到Hx或LRP-1在中性粒细胞或神经元上的表达。

Hx缺失损害功能恢复

功能实验表明，与野生型对照相比，Hx基因敲除(Hx^-/-)的雌性小鼠在BMS评分上从损伤后第5天至第14天表现出显著的运动功能受损。雄性Hx^-/-小鼠的BMS评分虽有恶化趋势但未达统计学显著性。然而，在更能反映精细运动和本体感觉的水平梯行走测试中，无论雌雄，Hx^-/-小鼠的失误次数均显著多于野生型小鼠，证实了Hx对运动功能恢复的保护作用。

Hx缺失不改变病灶中心体积但影响其延伸范围

通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色评估损伤体积发现，虽然在损伤 epicenter（中心）的最大损伤体积无组间差异，但雌性和雄性Hx^-/-小鼠的总体损伤范围（向头尾方向的延伸）均显著大于野生型小鼠。

Hx对SCI后神经元损失的保护作用

神经元计数显示，在损伤后35天，距离损伤中心224微米处，雄性Hx^-/-小鼠的NeuN阳性神经元数量显著少于野生型对照，而雌性组间无差异。在损伤后第5天，雄性Hx^-/-小鼠损伤区附近的SMI-32阳性轴突终末样结构（指示轴突损伤）数量也显著少于野生型，这可能暗示了更早的神经元丢失和清除。雌性组间则无此差异。

Hx缺失改变SCI后的炎症表型

基因表达分析显示，在损伤后1天，与仅接受椎板切除术的对照组相比，野生型小鼠脊髓中促炎细胞因子Tnf、Il1b和Il6的mRNA表达均显著升高。出乎意料的是，Hx的缺失反而降低了雌性和雄性小鼠中Tnf和Il1b的表达水平。此外，仅在雄性Hx^-/-小鼠中观察到抗氧化酶Sod2的表达下调以及促凋亡标志物Bax的表达上调。

Hx缺失以性别特异性方式影响中性粒细胞数量

细胞计数发现，在损伤后1天，雌性Hx^-/-小鼠损伤中心的中性粒细胞（Ly-6B2阳性）数量显著高于野生型对照，而雄性Hx^-/-小鼠则显著低于野生型对照。至损伤后5天，小胶质细胞/巨噬细胞（Iba-1阳性）和星形胶质细胞（GFAP阳性）的数量在基因敲除与野生型小鼠之间（无论雌雄）均无显著差异。

Hx^-/-小鼠在SCI后表现出脂质过氧化增加

对脂质过氧化标志物4HNE的分析表明，在损伤后35天，雌性Hx^-/-小鼠损伤区附近的4HNE染色强度显著高于野生型，而雄性小鼠仅呈现升高趋势。进一步检测铁死亡（一种铁依赖性的程序性细胞死亡）相关基因发现，雌性Hx^-/-小鼠在损伤后5天，铁死亡抑制因子Hspb1的表达显著降低，至第7天仍有下降趋势；雄性小鼠则无显著变化。对于另一个关键铁死亡抑制因子Gpx4，雄性Hx^-/-小鼠在5天时表达显著降低，而雌性小鼠则在7天时表达显著降低。

综上所述，本研究系统阐明了血红素结合蛋白Hx在脊髓损伤中扮演着重要的组织保护角色。其保护机制存在显著的性别二性：在雌性小鼠中，Hx的缺失主要导致更严重的中性粒细胞浸润、脂质过氧化以及铁死亡抑制通路（Hspb1, Gpx4）的下调；而在雄性小鼠中，则表现为更显著的神经元丢失、轴突损伤减少（提示早期清除）、成熟中性粒细胞减少以及早期抗氧化（Sod2）和促凋亡（Bax）信号的改变。这些发现不仅深化了我们对脊髓损伤后血红蛋白毒性作用机制的理解，更重要的是揭示了干预策略可能需要考虑性别因素。靶向Hx通路或补充外源性Hx，有望成为减轻脊髓损伤后继发性损伤、促进神经功能恢复的潜在治疗新策略，尤其需要探索其在不同性别中的差异化效果。未来研究将聚焦于Hx替代疗法的开发及其性别特异性影响的深入机制探索。