TEX 细胞共享TRM 基因特征
实验系统如连体共生或移植已证明TRM 细胞的非循环行为。这类研究导致发现了TRM 相关标志物，包括CD69和CD103，它们将TRM 细胞与循环记忆T细胞（TCIRCM ）区分开来。然而，TEX 细胞也停止迁移并驻留于肿瘤中。因此，研究人员假设TEX 细胞利用与TRM 细胞相同的转录程序来抑制迁移，导致这两个群体之间存在相当大的转录重叠。确实，来自急性病毒感染模型的TRM 转录谱与来自慢性 versus 急性LCMV感染的TEX 转录谱显著相关。鉴于TRM 和TEX 细胞之间的这种重叠，研究人员推断TRM 基因特征可以在单细胞RNA测序数据集中识别TEX 细胞。使用已发表的小鼠急慢性LCMV感染脾脏CD8+ T细胞数据，他们发现TRM 基因特征在慢性感染期间的终末TEX 细胞中富集程度最高。在鼠源乳腺癌及邻近组织的CD8+ T细胞中，TRM 基因特征在从肿瘤中分离出的肿瘤特异性TEX 细胞中高度富集，类似于邻近组织中的病毒特异性细胞。因此，利用TRM 基因特征来识别肿瘤内TRM 细胞会导致错误的TEX 细胞识别。
许多研究通过CD69和CD103共表达来鉴定肿瘤中的TRM 细胞。CD69+ CD103+ CD8+ T细胞存在于非癌组织和肿瘤中，后者可能包含TRM 和TEX 细胞的混合群体。因此，CD69、CD103和TRM 基因特征似乎都不足以区分可能共存的TRM 和TEX 细胞。鉴于组织驻留特征的这种重叠，研究人员着手通过制定两个可检验的假设来区分人类肿瘤中的TRM 和TEX 群体。首先，在健康、非炎症组织中富含核心驻留基因和特征的细胞主要是真正的TRM 细胞，而表达这些特征的肿瘤来源细胞则包含TRM 和TEX 群体。其次，通过相对存在或缺乏耗竭相关基因特征，可以进一步将表达驻留相关特征的肿瘤来源细胞分离为TEX 和TRM 细胞。为此，研究人员对人类乳腺癌肿瘤和正常乳腺组织中的CD3+ T细胞进行了单细胞转录组和表面蛋白测序（CITE-seq）及T细胞受体（TCR）分析。来自乳腺癌肿瘤和乳腺组织的CD8+ T细胞分布在15个簇上，根据蛋白质和转录谱分为五个主要T细胞亚群。CD103+ ‘驻留T细胞’共享典型驻留基因的表达，并下调控制主要组织排出促进基因产物的KLF2 。
根据上述假设，研究人员将肿瘤来源的CD103+ 驻留T细胞定义为包含TRM 和TEX 群体，而健康组织来源的细胞主要包含TRM 细胞。因此，他们将两个CD103+ 簇定义为TRM 细胞，因为它们主要存在于健康组织中；而主要存在于肿瘤中且在健康组织中基本缺失的簇被归类为TEX 细胞。伪批量主成分分析证实了TRM 和TEX 簇之间的区别，同时突出了它们在主成分1轴上的相似性，这主要由与T细胞排出相关基因的下调所驱动。支持这些注释的是，已发表的TRM 基因特征在TRM 和TEX 群体中均富集，而TEX 基因特征仅在TEX 细胞中选择性富集。TEX 和TRM 细胞群体的分离显示，尽管它们共享CD103、CD69和ZNF683 的表达以及KLF2 的下调，但TEX 细胞表达更高水平的CD38、CD39、PD-1、CTLA4、TIGIT 和HAVCR2 。这些数据表明，人类肿瘤中的TEX 细胞共同选择了一个驻留程序，并且常用的TRM 细胞相关蛋白质或基因特征无法区分TRM 和TEX 群体。
TRM 和TEX 细胞表现出不同的功能能力
为了解开肿瘤相关的TRM 和TEX 细胞，研究人员从乳腺癌数据集中开发了能够准确区分这些群体的基因特征。基因基于TRM 细胞与其他T细胞亚群相比的差异表达被纳入TRM 基因特征，随后在TRM 和TEX 元簇之间进行连续的差异表达分析。采用类似的方法推导出TEX 基因特征。虽然TRM 和TEX 细胞都由CD103表达和KLF2 下调定义，但它们通过包括CD94、CD161、CD73、CD38、CD101、CD39、GNLY 和PD-1在内的标志物进一步区分。这使得能够通过循环免疫荧光显微镜和流式细胞术可靠地区分这两个群体，从而检查它们的瘤内位置和功能特性。
使用47个标志物的循环免疫荧光面板，研究人员在七名乳腺癌患者中识别出CD103+ KLF2− CD8+ T细胞。这些细胞根据GNLY和PD-1的相对表达分层为GNLYHi PD-1Lo 和GNLYLo PD-1Hi 群体，分别近似于TRM 和TEX 细胞。GNLYLo PD-1Hi 细胞表达更高水平的CD39和LAG3，与耗竭表型一致。CD103+ KLF2− CD8+ T细胞的无偏聚类强化了这种区分。空间分析显示，两个群体都定位在panCK+ 肿瘤区域附近。然而，GNLYLo PD-1Hi 细胞平均显著更接近panCK+ 肿瘤细胞，表明其具有更高的直接肿瘤相互作用潜力。
除了表型和空间差异，研究人员还观察到TRM 和TEX 群体之间不同的功能能力。在体外再刺激后，TRM 细胞表现出更高的干扰素γ、肿瘤坏死因子和白介素2的产生，并显示颗粒溶素表达升高，而TEX 细胞表达更多的颗粒酶A和颗粒酶K。此外，在转录组数据集中对这些群体的反卷积显示，TRM 基因特征的富集与乳腺癌患者改善的总生存期相关，而TEX 基因特征的富集与较差的结局相关。这种关联似乎是乳腺癌亚型特异性的，因为三阴性乳腺癌的生存期最好由总CD103+ 细胞预测。进一步，研究人员测试了TRM 和TEX 特征与免疫检查点阻断反应的关系，揭示了具有较高TEX 基因特征表达的患者更可能在免疫检查点阻断后达到病理完全缓解，而升高的TRM 特征表达对免疫检查点阻断反应性无关紧要。这些数据表明，尽管TRM 细胞与乳腺癌的良好预后相关，但当前的免疫检查点阻断疗法专门靶向并增强TEX 细胞介导的抗肿瘤反应。
TRM 和TEX 基因特征在不同肿瘤中描绘TRM 细胞
为了确定这些乳腺癌TRM 和TEX 基因特征在不同肿瘤类型中的适用性，研究人员接下来从肝肿瘤中分离的CD8+ T细胞开发了特征以进行比较。为此，他们对来自结直肠癌患者肝转移、配对非癌肝组织以及无癌供体肝组织的CD8+ T细胞进行了CITE-seq。鉴定了两个CD103+ 驻留T细胞簇，并如上所述将其表示为TEX 和TRM 群体，其中TEX 细胞主要存在于肿瘤来源的组织中，而TRM 簇存在于肿瘤和非癌组织中。与在乳腺癌中的发现一致，他们发现TRM 和TEX 群体都富集了已发表的TRM 基因特征，但非TEX 基因特征。肝TRM 和TEX 特征可以准确识别乳腺癌TRM 和TEX 细胞，类似地，乳腺癌TRM 和TEX 特征分别识别了肝TRM 和TEX 细胞。总体而言，乳腺癌TRM 特征基因在肝TRM 细胞中高度富集，反之亦然，各自的TEX 基因特征也是如此，突出了来自不同肿瘤类型的肿瘤相关TRM 和TEX 细胞之间共享的基因表达。
虽然TRM 和TEX 特征内的基因集合在乳腺癌和肝肿瘤之间强烈相关，但单个基因和表面蛋白的表达并不普遍一致。例如，CD94、CD101、CD161和CD73在乳腺癌中特异性地在TRM 细胞中富集，但在肝源肿瘤中则不然。因此，在跨不同环境推断单个基因和蛋白质时必须谨慎。尽管如此，通过关注前沿基因，研究人员定义了广泛适用的泛癌TRM 和TEX 特征。使用这些基因特征，他们可以在来自多个数据集的多种肿瘤中区分TRM 和TEX 细胞。来自泛癌图谱的样本综合显示，TEX 细胞主要检测于肿瘤来源的组织，并且在非癌健康组织中基本缺失。按肿瘤类型分析时，TEX 和TRM 细胞的相对丰度各不相同，在所检查的癌症中，黑色素瘤、食道癌和B细胞淋巴瘤显示出最高的TEX 与TRM 比率。该比率与肿瘤突变负荷呈正相关，表明新抗原负荷可能优先促进TEX 细胞的形成。总体而言，这些数据证明了他们在各种肿瘤环境中反卷积TRM 和TEX 细胞的能力，促进了对它们功能和发育差异的详细研究。
肿瘤相关TRM 细胞克隆独特且富含病毒特异性细胞
鉴于TEX 细胞丰度与肿瘤突变负荷之间的相关性，研究人员假设TEX 和TRM 群体可能在克隆上不同，反映了抗原特异性的差异。因此，他们检查了乳腺癌数据集和泛癌图谱中T细胞亚群前100个扩增TCR克隆的克隆重叠。在两个数据集中，TRM 和TEX 细胞彼此之间的克隆重叠有限，反而显示出与TEM 细胞更大的克隆重叠。高Jaccard相异度得分支持了这一点，表明肿瘤来源的TRM 、TEX 和TEM 细胞的TCR库在很大程度上是不同的。在乳腺癌数据集内，扩增的克隆偶尔在亚群间共享，大多数共享发生在TRM 和TEM 或TEX 和TEM 之间，而不是直接在TRM 和TEX 之间。由于乳腺癌数据集、肝数据集或泛癌图谱中没有公共TCR存在，研究人员汇集了TCR数据进行进一步检查。他们评估了TRM 、TEX 和TEM 细胞在不同阈值下的克隆型共享，发现尽管有大量扩增的克隆，但TRM 、TEX 和TEM 细胞之间的大多数克隆重叠是由于单个共享细胞造成的。这些数据表明，虽然单个克隆可以呈现TRM 、TEX 或TEM 表型，但对于给定的TCR，优先发展其中一个亚群。
结构相似的TCR被预测识别相似的表位。使用TCRdist，研究人员识别了TRM 和TEX 细胞TCR之间的明 显 结 构 分 离
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