晚期慢性肝病（ACLD）是全球重大的健康负担，每年导致超过两百万人死亡，其病理过程通常发展为肝硬化。在慢性肝脏炎症过程中，正常的肝实质被瘢痕组织和再生结节所取代。尽管肠道微生物群的紊乱与ACLD的病理生物学密切相关，其特征是细菌多样性减少、机会性病原体增加，但微生物群究竟如何具体贡献于疾病机制，仍缺乏清晰的认知。尤其值得注意的是，在ACLD患者的肠道微生物中，通常存在于口腔的细菌（如韦荣球菌属和链球菌属）其相对丰度会升高，这种现象在结直肠癌、类风湿性关节炎等其他疾病中也有报道，暗示着口腔微生物向肠道的“易位”可能扮演着重要角色。然而，一个关键问题悬而未决：这些细菌是真正从口腔“ translocation”（易位）并成功在肠道“定植”（engraftment），还是仅仅反映了肠道局部环境变化导致的增殖？它们又是如何参与ACLD的疾病进展（ disease contribution）的？这些谜题亟待解开。
为了深入探究口腔-肠道易位在ACLD中的作用，由Shen Jin、Aurelie Cenier等人领导，Vishal C. Patel和Melanie Schirmer作为共同通讯作者的研究团队，在《Nature Microbiology》上发表了他们的最新研究成果。研究人员开展了一项精心设计的队列研究，招募了86名ACLD患者（涵盖代偿期ACLD[cACLD]、急性失代偿期[AD]和慢加急性肝衰竭[ACLF]不同疾病阶段），并设置了两个对照组：52名健康个体（Ctrl:HC）和14名无基础肝硬化的脓毒症患者（Ctrl:Septic）。他们对收集的配对唾液和粪便样本（共计266份样本）进行了深度宏基因组测序。研究策略的核心在于整合微生物菌株水平分析和功能谱分析，并结合详细的临床数据（包括Child-Pugh评分、终末期肝病模型[MELD]评分以及肠道屏障损伤标志物血浆脂肪酸结合蛋白2[FABP2]），旨在识别与疾病病理生物学相关的特定细菌基因或功能。
本研究主要运用了以下关键技术方法：1） 多队列配对样本（唾液与粪便）的宏基因组测序与生物信息学分析（包括MetaPhlAn3物种分析、StrainPhlAn3/PanPhlAn3菌株分析、基因目录构建与功能注释）；2） 临床菌株的厌氧分离培养与鉴定（从患者样本中分离出口腔-肠道易位相关细菌）；3） 绝对定量技术（qPCR，使用通用16S引物和物种特异性引物[nifJ]定量总细菌负荷和特定物种如V. parvula的丰度）；4） 动物模型验证（采用四氯化碳[CCl4 ]诱导的小鼠肝纤维化模型，并灌胃给予患者来源的口腔分离菌株）；5） 分子生物学实验（克隆V. parvula的prtC基因至大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组蛋白表达）；6） 功能活性检测（使用EnzChek试剂盒检测粪便上清液和重组蛋白的胶原酶活性）；7） 组织学与免疫荧光分析（天狼星红染色评估肝和肠纤维化，免疫荧光观察肠道紧密连接蛋白[E-cadherin, occludin]定位）。
研究结果
口腔微生物组在疾病早期发生改变，且口腔-肠道相似性随ACLD进展而增加
分析发现，ACLD患者肠道微生物组多样性降低，而口腔微生物组多样性仅在ACLD患者中下降，并且在AD和ACLF患者中下降更为显著。重要的是，口腔微生物组的失调似乎在更早的疾病阶段（cACLD）就已经出现。患者个体内的口腔和肠道微生物组相似性在所有ACLD组中均显著增加，共享的物种数量也随疾病严重程度而增加。其中，V. parvula、V. atypica、S. salivarius和S. parasanguinis是最常在配对唾液和粪便样本中共享的物种。这些发现暗示口腔微生物组在ACLD进展中起作用，口腔菌群失调可能先于肠道变化发生。
在ACLD患者的配对唾液和粪便样本中检测到高度相似的菌株
通过菌株水平分析（基于标记基因SNP的系统发育距离和基于泛基因组基因存在-缺失模式的相似性），研究人员发现，对于大多数候选易位物种，同一患者口腔和肠道内的菌株高度相似，而不同个体样本中的菌株则表现出显著的多样性，这为细菌的口腔-肠道易位提供了计算生物学证据。随后，他们成功从患者样本中分离出高度相似的V. parvula、V. dispar、S. gordonii和S. parasanguinis菌株（平均核苷酸一致性[ANI] > 99.98%）。
ACLD中口腔-肠道易位增加与疾病严重程度和肠道屏障功能障碍相关
这些口腔-肠道易位菌在ACLD肠道中的累积丰度显著增加，并且V. parvula、V. atypica等物种的粪便丰度与Child-Pugh评分、MELD评分等临床严重程度指标呈正相关。通过qPCR直接证实，AD患者粪便中V. parvula的绝对丰度显著升高。更重要的是，所有已识别的口腔-肠道易位菌的总体绝对丰度在AD患者中均有所增加。此外，这些易位菌的粪便丰度与血浆FABP2水平（肠道上皮损伤和通透性增加的标志物）呈正相关，提示口腔细菌的异位肠道定植可能与ACLD进展和肠道屏障损伤存在潜在联系。
ACLD肠道屏障损伤与口腔-肠道易位菌共享的一种细菌胶原酶基因相关
为了找出易位菌株特有的、可能参与异常宿主-微生物相互作用的基因，研究人员进行了功能组（FG）分析。他们筛选出52个在易位菌中常见、但在健康肠道常见共生菌核心基因组中通常缺失的FG。其中，与血浆FABP2水平最相关的两个FG涉及蛋白水解活性，包括一个嗜热金属蛋白酶（M29）和一个属于具有胶原降解酶活性的蛋白酶家族（U32蛋白家族）的肽酶。一个著名的例子是牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的蛋白酶C（prtC），它能降解人类I型胶原。易位菌共享的prtC同源物与P. gingivalis的胶原酶编码基因具有相似的结构域组织，尽管序列相似性较低（40%），但预测的蛋白质结构高度相似（RMSD < 4.7 Å），提示其可能具有降解人类I型胶原的能力。实验证实，AD患者粪便样本中的胶原酶活性显著高于对照组。总prtC基因丰度在ACLD粪便样本中显著增加，特别是在AD患者中（较健康对照组平均增加94.8倍）。这一信号在多个独立ACLD队列中得到重复验证，但在炎症性肠病（IBD）队列或健康人群中未观察到显著增加。使用prtC累积丰度作为特征，能够可靠地区分ACLD患者（尤其是AD患者）与对照组（auROC=0.89, auPR=0.91），并在验证队列中表现出优异的预测性能。
口腔-肠道易位菌的临床分离株在CCl4 小鼠模型中加剧肠道屏障功能障碍和肝纤维化
动物实验表明，灌胃给予携带prtC基因的口腔患者分离株（V. parvula, V. dispar, S. parasanguinis）会加剧CCl4 诱导的肝纤维化小鼠的肠道屏障损伤，表现为结肠白蛋白水平进一步升高，紧密连接蛋白（E-cadherin和occludin）从上皮细胞基底侧错误定位至胞质。同时，该处理还加剧了肝脏和肠道纤维化，并引起了远端回肠细菌过度生长（SIBO）。肝脏纤维化程度与结肠白蛋白水平呈正相关趋势，支持了肠道屏障功能障碍与肝纤维化加剧之间的联系。
V. parvula prtC胶原酶活性的实验验证
最后，研究人员通过分子克隆技术在E. coli BL21(DE3)中表达了V. parvula的prtC基因。功能测定明确证实，诱导表达的重组prtC蛋白具有活跃的胶原酶功能。
研究结论与意义
本研究通过数据驱动的计算预测与体外、体内实验验证相结合，为口腔-肠道易位在ACLD中的起源和后果提供了深刻的机制性见解。主要结论包括：1） 在ACLD患者中，高度相似的细菌菌株存在于配对的唾液和粪便样本中，且这些口腔-肠道易位菌的绝对丰度增加，为肠道定植提供了证据。2） 这些易位菌独特共享一个编码胶原酶样蛋白酶的prtC基因，该基因在典型的肠道共生菌中缺失。3） prtC基因的粪便丰度是ACLD的强大生物标志物。4） 动物实验证实，口服患者分离株会加剧肠道屏障损伤、肠道和肝脏纤维化以及SIBO。5） 体外实验验证了V. parvula的prtC基因具有胶原酶活性。
这些发现首次建立了口腔-肠道易位（通过特定的胶原酶降解细菌基因和菌株）与ACLD肠道屏障损伤（“肠漏”假说）和肝纤维化进展之间的直接机制联系。将口腔微生物组与ACLD病理生物学联系起来，有望促进新治疗方法的开发，例如通过恢复肠道共生菌群来对抗异位定植，或干预口腔微生物。此外，类似的机制可能也在其他慢性炎症性疾病（如IBD、结直肠癌）中发挥作用。该研究的设计和计算策略为在这些疾病中研究和识别微生物衍生的机制提供了一个强大的框架。
打赏
