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为解决 hPSCs 遗传变异对 RPE 分化及致瘤性影响不明的问题，谢菲尔德大学等研究人员开展 20q11.21 变异研究。结果显示其能增强 RPE 分化且体外致瘤风险低。推荐一读，助您了解干细胞疗法安全性相关关键进展。
在眼科医学领域，年龄相关性黄斑变性（AMD）犹如一颗 “定时炸弹”，无情地剥夺着无数老年人的光明，成为全球范围内不可治愈的主要致盲原因。这种疾病的 “罪魁祸首” 是视网膜色素上皮（RPE）细胞的退化，这些细胞对于维持视网膜功能和视觉健康至关重要，就像是视网膜的 “守护者”，一旦它们出了问题，视网膜的正常运作也会受到严重影响。
随着医学技术的发展，基于人类多能干细胞（hPSCs，包括人类胚胎干细胞 hESCs 和诱导多能干细胞 ）的细胞疗法为治疗 AMD 带来了新希望。hPSCs 就像是 “万能细胞”，可以分化成各种细胞，其中就包括能够修复受损视网膜的 RPE 细胞，目前相关的临床试验正在如火如荼地开展。但在 hPSCs 分化成 RPE 细胞的过程中，却出现了一些让人担忧的状况。
原来，在 hPSCs 的培养过程中，经常会出现遗传异常，这些异常就像隐藏在细胞里的 “小恶魔”，给 hPSCs 带来在培养中的优势，然而它们对临床相关细胞后代的影响却还是个未知数。在众多遗传异常中，有一种名为 20q11.21 拷贝数变异（CNV）的情况格外引人关注。这一变异在全球约 20% 的 hPSC 系中都能被检测到，它携带的致癌基因可能会带来肿瘤发生的风险。更麻烦的是，这种变异在常规的 hPSC 核型检查中很容易被忽视，因为它常常低于 G 显带核型分析的分辨率，就像一个 “隐形的敌人”，难以被轻易发现。
之前就有因遗传变异而导致临床试验受阻的例子。在一次 AMD 治疗的临床试验中，由于使用的 RPE 细胞存在未知影响的遗传变异，导致试验不得不暂停，这让人们深刻认识到了解这些遗传变异对 RPE 细胞影响的重要性。而且，虽然已经知道一些遗传变异的驱动基因，比如 20q11.21 变异中的 BCL2L1 基因（编码抗凋亡蛋白 BCL-XL ），但这些变异对 hPSCs 衍生物的影响却知之甚少，尤其是它们在人体中的长期致癌风险，几乎还是一片空白。
为了攻克这些难题，来自谢菲尔德大学干细胞生物学中心等研究机构的科研人员，在《Stem Cell Research & Therapy》期刊上发表了一篇名为 “Gain of 20q11.21 enhances retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells without promoting tumorigenicity” 的论文。他们经过一系列研究得出结论：20q11.21 变异能增强 hPSCs 向 RPE 细胞分化的速度和产量，且这种增强依赖于 BCL-XL 的活性；20q11.21 变异的 RPE 细胞在体外没有恶性转化的能力。这一研究成果为 hPSCs - RPE 细胞疗法的安全性评估和风险预测提供了重要依据，对推动细胞疗法治疗 AMD 有着重要意义。
科研人员在研究过程中，运用了多种关键技术方法。他们通过核型分析（karyotyping）和荧光原位杂交（FISH）技术，对细胞的染色体进行检测，观察是否存在异常。利用定量 PCR（q - PCR）技术，检测特定基因座的拷贝数变化，从而确定 20q11.21 区域的情况。借助细胞培养和分化技术，让 hPSCs 向 RPE 细胞分化，并观察其过程和结果。运用免疫荧光、实时定量 PCR、ELISA 等技术，对分化后的 RPE 细胞进行表型和功能的检测，判断其是否正常。
下面来详细看看他们的研究结果。
科研人员此前分离出了带有 20q11.21 异常的 hESCs，并保存了其野生型和变异型的克隆系。在进行 RPE 分化实验时，他们惊奇地发现，带有 20q11.21 变异的克隆系形成的色素沉着灶数量比正常克隆系多得多。通过扫描仪对色素沉着区域进行量化分析后发现，在自发分化的几周时间里，20q11.21 变异克隆系形成 RPE 病灶的速度明显更快，密度也更高。而且，与其他正常的 hPSCs 系相比，20q11.21 变异细胞产生的 RPE 产量也更高。基因表达分析进一步证实，20q11.21 变异克隆系中 RPE 细胞的关键标记物，如 PMEL17、CRALBP、OTX2 和 BEST 等的表达水平比野生型克隆系更高。这一系列结果表明，20q11.21 变异克隆系在 RPE 分化方面具有明显优势。
科研人员从 20q11.21 色素沉着灶中分离出 RPE 细胞，发现这些细胞呈现出典型的 RPE 单层鹅卵石形态和色素沉着。它们能够分泌色素上皮衍生因子（PEDF），这是健康 RPE 细胞的一个重要标志，说明这些细胞具有正常的代谢活性。经过长达 6 个月甚至 10 个月的连续培养，科研人员发现这些细胞仍然能够稳定地表达 RPE 细胞的特征标记物，且没有出现异常增殖的情况，在培养 6 个月和 10 个月时都能保持清晰的单层结构。不过，当这些细胞传代到第 4 代时，会出现形态变化，细胞变大并出现白色的细胞内区域，但这种现象在正常 RPE 细胞中也同样存在。由此可见，20q11.21 RPE 细胞能够发育成典型的单层细胞，并且在形态、标记物和代谢活性方面都具有长期稳定性。
科研人员猜测 BCL-XL 在 20q11.21 变异体的 RPE 分化增强过程中发挥着重要作用。为了验证这一猜测，他们在整个 RPE 分化过程中使用一种强效且选择性的 BH3 模拟配体 A1155463（简称 BCL-XLi）来抑制 BCL-XL 的活性。通过检测 caspase 3 的活性，他们发现这种抑制剂有效地抑制了 BCL-XL 的功能。在持续抑制 BCL-XL 9 周后，20q11.21 变异体的色素沉着灶产量大幅下降，这表明 BCL-XL 对于 20q11.21 变异体增强 RPE 分化起着关键作用。而且，科研人员通过实验发现，使用不可逆的 caspase 抑制剂 ZVAD-FMK 处理正常细胞，并没有显著增加其色素沉着，这说明 BCL-XL 增强 RPE 产量的作用可能是通过非凋亡途径实现的，不过具体机制还需要进一步深入研究。
对于 hPSCs 在细胞治疗中的安全性来说，移植细胞的恶性转化风险是一个关键问题。科研人员通过免疫细胞化学检测发现，6 个月大的 20q11.21 RPE 细胞中不存在多能性相关标记物 OCT4 和 TGF-β 。通过 qPCR 定量分析多能性标记物 Lin28 的表达，发现 20q11.21 RPE 细胞中 Lin28 的表达明显下调，这表明这些细胞中几乎没有未分化细胞的污染。此外，科研人员还进行了软琼脂集落形成实验，这是一种可靠的体外致瘤性检测方法。在实验中，20q11.21 RPE 细胞在 35 天的培养后，只形成了一个小聚集体，而作为对照的癌细胞系 HeLa 则形成了许多大而规则的集落。这说明 20q11.21 变异与 RPE 衍生物在体外的致瘤性没有显著相关性，20q11.21 RPE 细胞虽然存在异常核型和生存优势，但在体外表现出低恶性转化风险。
综合研究结果和讨论部分来看，这项研究有着多方面的重要意义。在细胞治疗方面，它让我们对 hPSCs 中常见的 20q11.21 变异有了更深入的了解。虽然 20q11.21 变异能够增强 RPE 分化，但考虑到其在其他系统中的致瘤性、可能作为后续致癌突变的易感因素以及 BCL-XL 对 RPE 衰老的影响，科研人员不建议使用携带这种变异的 RPE 细胞进行治疗。不过，研究结果可以帮助在 RPE 细胞治疗产品的制造过程中进行更科学的风险评估，如果在关键阶段检测到 20q11.21 变异，可以及时采取措施。在基础研究方面，该研究揭示了 BCL-XL 在 hPSCs 向 RPE 细胞分化过程中的新作用，为未来提高 RPE 细胞的分化效率和理解其生理病理机制提供了新的思路。或许在不久的将来，基于这些研究成果，科研人员能够找到更安全、更有效的治疗 AMD 的方法，为那些被黑暗笼罩的患者带来光明的希望。
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