在哺乳动物细胞中原位研究蛋白质，对于深入理解真核细胞生物学至关重要。为了在活的哺乳动物细胞中研究蛋白质，通常需要给目标蛋白添加氨基酸（从相对较小的肽到较大的融合蛋白不等）作为实验 “抓手”，以此在整个实验过程中追踪或控制目标蛋白。这些标签虽然给细胞内蛋白质研究带来了变革，但也存在局限性：它们可能影响目标蛋白的特性，并且在研究动态过程时大多缺乏时间分辨率。化学标签因其体积小、种类多样（超出了基因编码的氨基酸范围）而具有优势，然而将其应用于哺乳动物细胞中的蛋白质却困难重重。显然，在活的哺乳动物细胞中标记和操纵蛋白质，需要新技术的支持。
受化学生物学和基因编辑领域最新进展的启发，研究人员设想出一种能够在哺乳动物细胞内对蛋白质一级序列进行翻译后编辑的技术，这种技术还能作用于最能代表天然生物学状态的内源性蛋白质。该系统能够在用户指定的位点，将外源蛋白质片段拼接到目标蛋白中，实现时间上的精准控制，还能引入有用的标记和非经典氨基酸（noncanonical amino acids，ncAAs） 。为实现这一目标，研究人员设计了一种细胞内蛋白质编辑系统，该系统依赖两对分裂内含肽（split intein） 蛋白，这些蛋白可以分别连接多肽链。串联使用时，这些分裂内含肽能够将供体肽编辑到目标蛋白内部的受体位点。受体序列可以通过基因组编辑插入内源性蛋白，也可以插入外源表达的蛋白中。相应的供体蛋白通过重组产生，这样一来，如果有需要，就能大规模整合非经典氨基酸并进行化学标记。将供体蛋白导入活的哺乳动物细胞后，就能快速把供体编辑到目标蛋白中。
研究人员首先展示了一种通用的编辑方法，即将含有抗原决定簇标签的通用最小供体，编辑到模型蛋白钙连蛋白（calnexin）和 β - 肌动蛋白（β -actin）中。通过免疫印迹、荧光显微镜和基于质谱的蛋白质组学技术，他们证实了蛋白质一级序列发生了编辑。时间特性分析显示，在供体蛋白导入 10 分钟内就会发生编辑，这使得在生物学相关的时间尺度上开展实验成为可能。研究人员还展示了一种序列特异性编辑模式，转录因子 c - Myc 和激酶 Chk1 几乎无痕地被编辑，从而能够对这些动态蛋白质进行时间分辨研究。此外，利用蛋白质组学和转录组学方法，研究人员发现 Chk1 和 c - Myc 在编辑后仍然保持功能，这证明了该蛋白质编辑技术近乎无痕且干扰极小。
此外，研究人员在大肠杆菌（Escherichia coli）中利用基因编码扩展技术，将非经典氨基酸和点击化学手柄对叠氮基苯丙氨酸（p-azido-phenylalanine，pAzF）编码到供体蛋白中，然后再用小分子进行标记。之后，他们将小分子荧光团或生物素编辑到内源性钙连蛋白中，实现了对内源性蛋白质的显微镜观察和下拉实验，而且无需使用抗体。
这项研究建立了一种在活的哺乳动物细胞中编辑蛋白质一级氨基酸序列的方法。该方法能够在目标蛋白（包括内源性蛋白）中，实现非经典氨基酸和有用标记的位点特异性编辑。最终，该技术能够以无干扰且具有时间分辨率的方式标记和操纵蛋白质。这种蛋白质编辑方法是研究哺乳动物细胞中蛋白质的技术宝库中一项实用且应用广泛的新成员，有望在各种应用场景中，对几乎无穷无尽的目标蛋白进行编辑、操纵和观察。
生物通微信公众号
