皮层细胞类型特异性遗传工具包：增强型AAV载体与转基因小鼠系的开发与应用

时间：2025年5月22日

来源：Cell

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本研究针对哺乳动物大脑皮层细胞类型特异性标记难题，开发了包含1000多种增强型AAV载体和15种转基因小鼠系的综合工具包。通过整合单细胞转录组和表观基因组数据，研究人员筛选出高特异性（>90%）的遗传工具，实现了对皮层细胞亚类的精准靶向。该研究为解析大脑功能机制提供了重要资源，相关数据和工具已公开共享。

大脑作为最复杂的器官，其功能实现依赖于高度特异的细胞类型组成。然而长期以来，神经科学家们面临着一个关键挑战：如何精准靶向特定的皮层细胞类型进行研究。传统方法依赖于非系统性的细胞类型定义和标记基因发现，导致工具的分辨率和特异性有限。随着单细胞测序技术的发展，皮层细胞类型的分子特征已被详细描绘，但相应的遗传工具却严重匮乏。

为解决这一难题，Allen脑科学研究所的研究团队开展了一项系统性研究。他们整合单细胞转录组和表观组数据，开发了一套全面的遗传工具包，包含1000多种增强型腺相关病毒(AAV)载体和15种转基因小鼠系。该研究发表在《Cell》杂志，为理解大脑功能机制提供了重要资源。

研究采用了多项关键技术：单细胞多组学测序(snMultiome)分析小鼠和人类皮层样本；基于染色质可及性筛选候选增强子；通过PHP.eB伪型AAV载体实现血脑屏障穿透；利用荧光激活细胞分选(FACS)和单细胞RNA测序(SSv4)验证工具特异性；采用双光子断层扫描(STPT)进行全脑成像。人类样本来自中颞回(MTG)，小鼠样本来自视觉、体感和运动皮层。

在"皮层细胞类型特异性遗传工具设计与表征"部分，研究人员通过比较小鼠和人类表观基因组数据，筛选出802个候选增强子序列。这些序列被克隆到AAV载体中，通过视网膜后(RO)注射递送。结果显示约40%的增强子表现出靶向特异性，且小鼠和人类来源的增强子在皮层亚类水平表现相当。

"增强型AAV体内筛选"部分详细描述了评价体系。通过视觉评分将标记细胞群体(LCP)分为11个可区分类别，并评估标记密度和亮度。约65%的增强子在皮层产生标记，其中49%为靶向或混合标记。单细胞RNA测序进一步验证了54%的增强子在亚类水平特异性>70%。

"增强型AAV二次表征"展示了深度验证结果。通过FACS分选SYFP2⁺细胞进行测序，发现31%的增强子特异性>90%。全脑STPT成像揭示了轴突投射模式，有助于区分不同类型的皮层投射神经元。数据通过Genetic Tools Atlas和BioFileFinder公开共享。

在"增强子优化与用途多样化"章节，研究人员通过核心串联(3xCore)显著提高了表达强度。将SYFP2替换为Cre重组酶并采用突变体iCre(R297T)降低了非特异性重组。比较不同递送方式发现，脑室内(ICV)注射能提高信号强度，而立体定位注射可实现局部高浓度递送。

关于"转基因报告基因和驱动系"，研究团队开发了两种新型报告系(Ai193和Ai224)，能同时报告Cre和Flp活性。针对谷氨酸能细胞类型，基于Batf3、Chrna6等基因构建的转基因系实现了对L5_ET等亚类的标记。GABA能工具中，Lamp5-2A-FlpO与Slc32a1-IRES-Cre联用可特异性标记Lamp5亚类。

研究结论表明，这套工具包实现了对皮层细胞类型的高分辨率访问。约40%的增强子AAV表现出靶向特异性，通过优化可进一步提高性能。转基因工具与病毒工具各有优势，交叉验证可确保特异性。所有资源已通过Addgene和Jackson实验室公开，配套数据门户Genetic Tools Atlas提供了详细的使用指南。

该研究的创新性体现在三个方面：首先，建立了从基因组数据到功能验证的系统性工具开发流程；其次，证明了跨物种增强子的保守性，为人类研究提供了参考；最后，开发的优化策略如核心串联和重组酶突变体，为遗传工具设计提供了新思路。这些资源将极大促进对皮层在健康和疾病中功能的研究。