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研究人员开发了无需转基因的EPI-Clone方法，通过单细胞DNA甲基化测序(scTAM-seq)解析造血干细胞(HSC)克隆动态。研究发现老年小鼠和人类中克隆复杂性降低，存在低再生能力的HSC扩增克隆，且克隆造血(CH)突变与非突变克隆具有相似的髓系偏倚特征。该研究为理解衰老相关血液系统变化提供了新视角。
血液系统作为机体重要的生理屏障，其衰老过程一直备受关注。传统观点认为造血干细胞(HSC)随年龄增长会逐渐丧失功能，但对其在自然状态下的克隆动态变化知之甚少。现有追踪技术如遗传标记(LARRY系统)或线粒体DNA突变追踪存在局限性：前者需要基因工程改造，后者在系统发育重建上存在争议。更棘手的是，人类造血系统包含数万个HSC克隆，如何无创、高通量地解析其克隆行为成为重大挑战。
来自西班牙巴塞罗那科学公园等机构的研究团队在《Nature》发表突破性成果。研究人员创新性地发现DNA甲基化可同时编码细胞分化状态和克隆身份信息：部分CpG位点反映分化状态，另一部分则通过随机表观突变(epimutation)形成克隆特异性"条形码"。基于此，他们开发了EPI-Clone方法，结合靶向单细胞甲基化测序(scTAM-seq)，实现了无需转基因的大规模克隆追踪。
关键技术包括：(1)设计物种特异性CpG靶向panel，覆盖453个小鼠或448个人类差异甲基化位点；(2)利用Mission Bio Tapestri平台进行单细胞甲基化分析，同时读取表面蛋白表达；(3)开发EPI-Clone算法，通过静态CpG聚类识别扩增克隆；(4)对7名不同年龄人类捐赠者和多组年龄匹配小鼠的230,358个单细胞进行分析；(5)结合靶向RNA测序(SDR-seq)和线粒体变异分析进行多组学验证。
DNA甲基化图谱揭示双重信息层
研究人员首先建立了造血系统的单细胞甲基化图谱。通过整合28,782个小鼠造血干祖细胞(HSPC)数据，发现DNA甲基化可同时反映细胞状态和克隆身份：动态CpG与表面蛋白表达相关，富集于增强子区域；而静态CpG与克隆身份相关，富集于异染色质区。这种"双重编码"特性为克隆追踪奠定了基础。
EPI-Clone算法的开发与验证
研究团队开发的三步算法：(1)鉴定与表面蛋白无关的静态CpG；(2)通过局部细胞密度识别扩增克隆；(3)对扩增克隆细胞进行聚类。在LARRY标记的移植实验中，该方法准确识别>0.25%的克隆(AUC=0.79)，且克隆身份在10个月后仍保持稳定。值得注意的是，该方法在肺内皮细胞中也验证有效，提示表观条形码的广泛适用性。
小鼠衰老中的克隆动态
分析年轻(12周)与老年(100周)小鼠发现：老年鼠出现更多扩增克隆，且单个克隆更大。特别值得注意的是HSC扩增克隆——这些克隆包含大量干细胞但几乎不分化，移植后再生能力低下。相反，未扩增的"年轻样"克隆在老年个体中持续存在，成为造血主力。这一发现挑战了传统认知，提示衰老相关造血缺陷可能源于少数异常克隆的累积。
人类克隆造血的新认知
在人类队列中，EPI-Clone不仅准确识别已知CH突变克隆，还发现67个无驱动突变的克隆扩增。年龄超过60岁个体显示明显的克隆复杂性降低。引人注目的是，CH与非CH克隆均表现出髓系偏倚和干细胞富集特征，且克隆大小与GMP比例正相关。靶向RNA测序(scTAMARA-seq)进一步揭示HSC/MPP偏倚克隆具有独特的基因表达特征，如低TAL1和高CEBPA表达。
表观与线粒体条形码的比较
通过同时分析线粒体变异(scTAMito-seq)，研究发现仅部分线粒体突变(如mt:7076A>G)与EPI-Clone鉴定的克隆相关。这种不完美对应印证了线粒体突变在谱系追踪中的局限性，突显了表观条形码的稳定性优势。
这项研究通过创新的EPI-Clone方法，首次在自然状态下系统描绘了造血系统衰老的克隆动态图谱。其核心发现有三：(1)衰老伴随克隆复杂性降低，但功能性"年轻样"克隆持续存在；(2)HSC扩增克隆是衰老相关造血缺陷的主要来源；(3)CH突变只是年龄相关克隆扩增谱系的一部分。这些发现为理解造血衰老提供了新范式，也为开发延缓血液系统衰老的干预策略指明了方向。该方法的应用前景广阔，未来或可拓展至其他干细胞系统及癌症早期克隆演化研究。
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