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Oxr1与Ncoa7通过调控V-ATPase维持高尔基体/反式高尔基网络的最适pH环境以保障糖基化功能

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本研究揭示了TLDc家族蛋白Oxr1和Ncoa7作为Rab效应分子，通过直接结合V-ATPase催化亚基ATP6V1A并抑制其ATP水解活性，精确调控高尔基体/反式高尔基网络（Golgi/TGN）的腔室pH（6.0-6.7），为糖基化酶提供最适环境。该机制解析了分泌途径中pH梯度形成的分子基础，并为先天性糖基化障碍（CDGs）和溶酶体功能障碍相关疾病提供了新的治疗靶点。

研究背景

细胞内膜性细胞器的pH稳态对蛋白质翻译后修饰（如糖基化）、配体-受体互作及蛋白质稳态至关重要。分泌途径中，pH从内质网（ER，pH 7.1-7.2）到高尔基体/反式高尔基网络（Golgi/TGN，pH 6.0-6.7）再到溶酶体（pH 4.5-5.0）逐渐酸化，但不同细胞器间pH差异的调控机制尚不明确。空泡型ATP酶（V-ATPase）是维持酸性环境的关键质子泵，而TLDc结构域蛋白家族（包括Oxr1和Ncoa7）可能通过调控V-ATPase参与这一过程。

关键发现

Oxr1与Ncoa7作为Rab结合蛋白
通过GST pull-down和酵母双杂交实验，研究发现Oxr1/Ncoa7特异性结合GTP结合的Rab蛋白（如Rab6、Rab8、Rab10等），其膜定位依赖Rab活性。免疫荧光和亚细胞分级实验证实二者主要定位于高尔基体/TGN膜，与GM130、GRASP55和Syntaxin-6标记区域高度共定位。

直接抑制V-ATPase活性
免疫共沉淀和体外实验显示，Oxr1/Ncoa7通过其TLDc结构域结合V-ATPase的催化亚基ATP6V1A，且仅当ATP6V1A结合AMP-PNP（非水解型ATP类似物）时相互作用最强。利用嗜热菌V-ATPase的A₃B₃六聚体进行ATP酶活性检测，发现Oxr1/Ncoa7及其TLDc结构域可显著抑制ATP水解，而缺失TLDc的突变体无此功能。

调控高尔基体/TGN的pH稳态
在Oxr1/Ncoa7双敲除（Oxr1^KO/Ncoa7^KD）细胞中，pH敏感荧光探针检测显示高尔基体腔pH从6.41降至6.33，TGN腔pH从5.94显著降至5.54，表明二者通过抑制V-ATPase防止过度酸化。

糖基化缺陷与溶酶体功能障碍
凝集素印迹和免疫印迹分析发现，Oxr1/Ncoa7缺失导致N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和岩藻糖修饰减少，而唾液酸修饰未受影响。高度糖基化的溶酶体膜蛋白LAMP2和CD63在缺失细胞中呈现低分子量条带，经PNGase F处理后差异消失，证实糖基化异常。此外，溶酶体pH升高且对二氧化硅（SiO₂）诱导的膜损伤更敏感，而糖基化抑制剂（衣霉素/BADG）处理可模拟这一表型，提示糖基化缺陷是溶酶体功能障碍的主因。

机制模型

Oxr1/Ncoa7通过以下途径发挥作用：

1. Rab依赖的膜招募：GTP结合的Rab蛋白将其锚定于高尔基体/TGN膜；
2. V-ATPase负调控：TLDc结构域结合ATP6V1A，抑制质子泵活性；
3. 糖基化保障：维持最适pH确保糖基转移酶/糖苷酶活性；
4. 溶酶体保护：间接通过糖基化维持溶酶体膜完整性。

研究意义

该研究首次阐明TLDc蛋白通过Rab-V-ATPase轴调控细胞器pH梯度的分子机制，为先天性糖基化障碍和神经退行性疾病（如溶酶体贮积症）提供了新的病理机制解释和治疗靶点。未来需进一步探索其他TLDc家族成员（如TBC1D24、TLDC1/2）在细胞器pH调控中的分工。

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