你可能在最近的新闻中看到过：宾夕法尼亚州一名患有罕见遗传病的婴儿通过个性化治疗治愈了他的特定基因突变。该疗法是使用一种称为碱基编辑的基因编辑形式创建的，该方法由Alexis Komor创建，当时她是哈佛大学分子生物学家David Liu小组的博士后学者。
自该研究于2016年发表以来，Komor（现任加州大学圣地亚哥分校化学和生物化学副教授）一直在研究base编辑工具，以更好地理解和进一步发展其能力。她的最新研究发表于Nature Communications，概述了某些DNA修复蛋白可以被操纵以产生预期结果的方式。
我们的基因组DNA由四个碱基组成——胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和腺苷（A）。这些碱基结合成约30亿个不同的碱基对，以双螺旋结构排列。
人类99.9%的基因组成是相同的，而剩下的0.1%则是人与人之间任何差异的原因。如果一个人有C基，那么另一个人可能有T基。任何两个人之间都可能存在数以百万计的基因变异，尽管其中许多是无害的，但其他人可能会导致衰弱或晚期遗传病。
对于许多患有遗传病的人来说，基因编辑是他们治愈疾病的唯一希望。
传统上，基因编辑是使用CRISPR-Cas9对DNA进行物理改变。引导RNA将Cas9蛋白引导到特定的DNA位置，在那里Cas9完全切断DNA，称为双链断裂。细胞内有许多蛋白质可以检测DNA损伤，然后通过一种称为修复途径的过程修复DNA损伤。
通常，这些途径会将DNA的两个断裂端融合在一起，称为结扎。使用CRISPR-Cas9时，随着中断和修复次数的增加，不需要的插入和删除（称为indels）也会增加。当这种情况发生时，DNA链不再与原始DNA链匹配，编辑过程结束。
作为一名博士后，Komor找到了一种方法，通过避免双链断裂来实现基因编辑，从而提高效率，降低indels的发病率。她将这类新工具称为“碱基编辑”，因为它每次只改变一个字母的DNA碱基。
加州大学圣地亚哥分校化学和生物化学副教授Alexis Komor说：“通过基础编辑，我们不仅可以获得更好的结果，而且可以改进通向结果的步骤。双标破胶可能有毒，并可能导致细胞死亡。它们还可能导致大规模的基因组重排，因为你正在物理上切割DNA。基础编辑器避免了这种情况。"
Komor开发了两种工具，一种是腺嘌呤碱基编辑器（ABE），用于将A碱基转换为G碱基；另一种是胞嘧啶碱基编辑器，用于将C碱基转换成T碱基。基本编辑器通过中介进行转换。在CBE的情况下，胞嘧啶首先转化为尿嘧啶核酸发现于RNA中。在修复过程中，DNA将尿嘧啶读作胸腺嘧啶。
虽然没有双链中断，但基本编辑器确实在一条链中创建了一个缺口。一种酶附着在Cas9上，并通过化学方式改变碱基。CBE可以具有90-95%的转化率，并且具有最小的不需要的副产物。
我们知道基本编辑器可以工作，但如何工作？这是Komor团队想要回答的主要问题。他们想知道细胞是如何处理尿嘧啶的。尼克扮演什么角色？细胞中的所有不同蛋白质如何影响编辑结果？
一种叫做尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）的特殊蛋白质发现并删除尿嘧啶。当这种蛋白质存在时，不良结果的发生率就会上升。当UNG被抑制时，CBE效率增加。但Komor的团队并没有完全理解这一过程。
为了找到答案，该团队使用了一种称为基因敲除的技术，该技术可以抑制基因的自我表达能力。他们对人类基因组中每一个不同的DNA修复或处理蛋白质都进行了这项研究——总共2015个蛋白质。
然后，他们使用绿色荧光蛋白标记物来识别包含所需编辑的细胞，无论是C到T突变还是受UNG影响的C到G编辑，同时丢弃他们不想要的受UNG-影响的编辑。
他们使用CRISPRi筛选进行了这项工作，该筛选将引导RNA带到感兴趣的基因并减少其表达。Komor的CRISPRi细胞有两个引导RNA，一个用CBE激活荧光蛋白制造者，另一个直接敲除特定修复蛋白。总的来说，Komor拥有一个约12000种不同引导RNA组合的库，用于CRISPRi筛选。
一旦他们收集到所有发出绿色荧光的细胞，他们对引导RNA进行测序，以查看哪些基因被敲除（因此，它们的表达对碱基编辑有害）。
他们发现一种叫做Lig3的连接酶抑制了碱基编辑。连接酶将断裂的DNA链末端重新连接在一起，当Lig3存在时，CBE编辑降低。
Komor说：“我们认为Lig3可以潜入并将缺口密封起来。这样我们就没有机会将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶了。这就像是Lig3在与我们作对。”
他们还发现了一种称为错配修复的修复途径，实际上有助于胞嘧啶碱基的编辑。MutS-α蛋白复合物是错配修复的组成部分，由两种蛋白质组成，在细胞的整个生命周期中都会表达。当它被拆除时，C到T的转换率下降了。Komor认为这是因为MutS-alpha识别尿嘧啶中间产物并帮助其转化为胸腺嘧啶。
为什么这么大惊小怪？如果工具有效，为什么重要？
Komor说：“这些碱基编辑工具很好，但并不完美。如果我们能更好地了解它们在细胞中的功能，这将有助于我们了解如何提高它们的效率，甚至创建新类型的碱基编辑器。”
Komor还指出，出于安全考虑，了解这些工具是如何工作的很重要。碱基编辑是否会激活不可预见的手机响应？是否存在DNA损伤或细胞死亡？我们对碱基编辑器的机制和单元格的响应了解得越多，我们就越能更好地观察和阻止意外后果。
Komor说：“这就是这项工作得到国家科学基金会支持的原因之一。这是一门基础科学，即了解事物为什么是这样的，以及它们在特定环境中是如何运作的。”
通常需要几十年的时间才能看到基础科学研究对现实世界的影响，但Komor的基本编辑技术在更短的时间内就被应用到了医院。她指出，到目前为止，至少有10人使用CBE获救。此外，还有几项临床试验正在进行中，这意味着未来几年这一数字可能会大幅增加。
这项研究部分得到了国家科学基金会（MCB-2048207）、国家卫生研究院（T32GM146648）和科特雷尔奖学金科学促进研究公司（27975）的支持。
生物通微信公众号
