基于DNA测序的大规模并行免疫肽组技术揭示癌症抗原呈递新机制

本研究针对HLA(人类白细胞抗原)多态性导致的抗原呈递研究瓶颈，开发了名为ESCAPE-seq的高通量平台，通过单链三聚体(SCT)设计和DNA测序技术，实现了75,000种肽段-HLA组合的并行筛选。研究团队成功鉴定了来自致癌驱动突变和融合蛋白的广谱呈递表位，覆盖90%人群的HLA-A/B/C等位基因，并发现突变肽段与野生型差异呈递模式。该技术突破了质谱(MS)检测灵敏度低、计算预测算法(如NetMHC)对HLA-C等位基因预测不准等局限，为肿瘤免疫治疗和疫苗设计提供了全新工具。

在免疫系统与疾病的博弈中，人类白细胞抗原(HLA)如同精密的分子"身份证"，通过呈递细胞内肽段供T细胞识别。然而作为人类基因组最复杂的多态性区域，HLA家族拥有超过26,000种等位基因，这种多样性使得全面解析抗原呈递规律成为巨大挑战。传统质谱技术(MS)需要大量样本且难以区分多等位基因贡献，而NetMHC等计算预测工具对HLA-C等位基因和罕见突变表位的预测准确率有限。更严峻的是，现有免疫肽组数据严重偏向HLA-A2等常见等位基因，导致基于欧洲人群数据开发的疗法可能无法惠及全球患者。

斯坦福大学医学院(Stanford University School of Medicine)的Howard Y. Chang团队与南加州大学凯克医学院(Keck School of Medicine, University of Southern California)合作，开发了名为ESCAPE-seq的革命性技术。这项发表于《Nature Genetics》的研究通过巧妙改造单链三聚体(SCT)结构，将肽段-β₂微球蛋白(B2M)-HLA三者串联，利用只有稳定结合的肽段-HLA复合物才能转运至细胞表面的特性，建立了基于DNA测序的高通量筛选平台。研究人员引入Y84C突变增强复合物稳定性，通过流式细胞分选和深度测序，实现了对75,000种肽段-HLA组合的并行评估。

关键技术包括：(1)构建含50种HLA等位基因和1,500种肽段(来自92种致癌突变和31种融合蛋白)的组合文库；(2)利用B2M基因同义突变创建等位基因条形码系统；(3)通过四档荧光强度分选实现肽段-HLA结合强度的定量评估；(4)采用健康供体外周血单个核细胞(PBMC)验证免疫原性；(5)质谱验证HLA-C*03:04限制性表位。

单链pMHC trafficking揭示肽段-HLA结合特异性
通过改造SCT结构，研究人员发现只有高亲和力肽段能促使复合物正确折叠并转运至细胞表面。将HLA-A02:01与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)直接融合后，高亲和力pp65肽段显示膜定位，而无效结合肽段仅呈现弥散分布。这种特性在HLA-A01:01、B07:02、C04:01和小鼠H2-K^b等位基因中均得到验证，为高通量筛选奠定基础。

ESCAPE-seq平台验证与性能评估
与IEDB数据库和NetMHC4预测工具对比显示，ESCAPE-seq对高亲和力肽段的召回率>90%，受试者工作特征曲线下面积(AUC-ROC)达0.919。特别值得注意的是，该技术对训练数据稀少的HLA-C*04:01等位基因仍保持优异性能，解决了计算预测的瓶颈问题。

SARS-CoV-2变异株抗原呈递图谱
对刺突蛋白和核衣壳蛋白的3,500个肽段筛查发现，仅5-10%的肽段能被两种以上HLA等位基因呈递。引人关注的是，许多野生型非呈递肽段经单点突变后获得呈递能力，如omicron株的S371L突变使新表位被HLA-B*07:02识别，这为理解病毒免疫逃逸提供了分子基础。

癌症驱动突变的全人群新抗原发现
针对KRAS^G12V、BRAF^V600E等92个热点突变的分析显示，EGFR^T790M和MED12^G44V等"公共新抗原"可被60%以上HLA等位基因呈递。而EWSR1-FLI1融合蛋白产生的新表位能被近30种HLA识别，PAX7-FOXO1融合却仅被一种HLA呈递，揭示不同致癌突变存在显著差异的免疫可见性。

突变型与野生型肽段的差异呈递
通过比较1,500对突变/野生型肽段，研究人员定义了四类呈递模式：约50%肽段呈现"共同呈递"(WT+Mut+)，而EGFR^T790M的LTSTVQLIM等表位显示"突变特异呈递"(Mut+ only)。体外实验证实，这类表位能激发健康供体CD8⁺T细胞产生IFN-γ⁺TNF-α⁺双阳性应答，而对应野生型肽段无此效应，证实其可绕过中枢耐受机制。

这项研究建立了抗原发现领域的新范式。ESCAPE-seq不仅解决了HLA-C等位基因研究滞后的问题，其单次实验覆盖50种HLA等位基因的能力，使建立全人群水平的抗原呈递图谱成为可能。发现的"公共新抗原"为开发通用型肿瘤疫苗提供了靶点库，而揭示的突变特异呈递机制则解释了为何某些致癌突变更易被免疫系统识别。该技术还可拓展至HLA-II类分子研究，为感染性疾病和自身免疫病的免疫机制解析提供新工具。随着个性化免疫治疗时代来临，这种将高通量DNA测序与经典免疫学原理结合的策略，或将成为破解人类免疫多样性的关键钥匙。