优化单硫醇硫氧还蛋白衍生物ORP100S：在体外和体内防护辐射与化疗毒性且不促进肿瘤增殖

时间：2025年9月13日

来源：Advanced Science

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本刊推荐：本文报道了一种工程化单硫醇硫氧还蛋白衍生物ORP100S，其通过理性设计克服了重组人硫氧还蛋白（rhTRX）的稳定性差、半衰期短和促肿瘤增殖等局限性。研究证实ORP100S在细菌系统中高效表达（16 g·L−1），通过皮下给药显著提升啮齿类和非人灵长类动物的致死性全身辐射存活率，并协同粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）保护造血干细胞/祖细胞（HSPCs）免受化疗损伤。机制研究揭示ORP100S通过调控KLF4-p53通路选择性抑制HSPCs铁死亡（ferroptosis），而不影响癌细胞死亡。该研究为开发新型辐射防护剂和化疗辅助药物提供了创新策略。

1 引言

硫氧还蛋白（TRXs）是一类参与氧化还原反应的蛋白质家族，通过两阶段硫醇-二硫键交换机制选择性还原分子内和分子间二硫键。人硫氧还蛋白-1（TRX）具有抗氧化、抗炎症和调控功能，能缓解多种器官系统的细胞应激，但其临床应用受限于快速清除率和促细胞内增殖活性。电离辐射（IR）和化疗药物均可对造血干细胞/祖细胞（HSPCs）造成损伤，而现有保护剂如粒细胞集落刺激因子（G-CSF）或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）疗效有限且系谱特异性强。重组人TRX（rhTRX）虽在动物模型中显示辐射防护效果，但存在稳定性差、半衰期短（约30-60分钟）和潜在促肿瘤风险等问题。

2 结果

2.1 单硫醇硫氧还蛋白衍生物（ORP100S）：分子工程、制备与表征

通过将TRX活性位点半胱氨酸（Cys）₃₅替换为丝氨酸（Ser），并引入三个非活性位点突变，设计出单硫醇TRX衍生物ORP100S。该变体在大肠杆菌中实现高产表达（16 g·L⁻¹），并通过冻干工艺获得稳定还原态制剂。ORP100S在溶液中保持100%活性超过5天，而天然TRX易形成失活二聚体。采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）建立单周转胰岛素还原 assay，证实ORP100S与天然TRX具有相似的蛋白二硫键还原动力学，但其通过形成稳定混合二硫键延长靶标结合时间。在原发性人支气管上皮细胞（HBECs）模型中，ORP100S比天然TRX更有效抑制囊性纤维化（CF）患者细胞的肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）释放。

2.2 ORP100S在辐射救援中比rhTRX更有效且不促进癌细胞增殖

在小鼠EML造血干细胞和人工脐带血CD34⁺细胞中，ORP100S显著促进增殖并降低细胞内活性氧（ROS）和NAD⁺/NADPH比率，提高谷胱甘肽（GSH）水平。然而，在多种癌细胞系（如HT29结肠癌、MM1.R骨髓瘤、MV4-11白血病）中，ORP100S无增殖刺激作用。经5 Gy辐射后，ORP100S保护EML和CD34⁺细胞存活，并抑制p53转录及其下游靶点MDM2、ASPP1和p21表达，而rhTRX对癌细胞和正常细胞均具保护作用。

2.3 ORP100S与rhTRX在化疗保护中呈现差异化效应

在5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂、多柔比星和依托泊苷处理的EML和CD34⁺细胞中，ORP100S比rhTRX更有效缓解化疗毒性，但不保护癌细胞。ORP100S减弱化疗诱导的p53通路上调，而rhTRX对癌细胞和正常细胞均具保护效果。

2.4 ORP100S在啮齿类和灵长类动物中缓解辐射损伤

C57Bl/6小鼠接受9.5 Gy全身辐射后24小时，皮下注射ORP100S（128 µg，隔日一次，共5剂）使50%动物存活至40天。剂量范围研究确定128 µg皮下给药为最优方案。在食蟹猴中，ORP100S（7.1 mg·m⁻²）显著延长4 Gy全身辐射后的生存期（p = 0.0455），并改善血液学参数（如白细胞、血红蛋白、血小板计数）。ORP100S治疗还升高组织修复相关趋化因子SDF-1水平，降低炎症相关CD40配体（CD40L）表达。

2.5 ORP100S保护HSPCs免受化疗血液毒性而不影响抗肿瘤效果

在EG7淋巴瘤和B16-F10黑色素瘤小鼠模型中，ORP100S与5-FU或顺铂联用不干扰化疗药物抗肿瘤活性，但显著改善化疗引起的全血细胞减少症，增加骨髓长期HSPCs（LT-HSPCs）、短期HSPCs（ST-HSPCs）和多能祖细胞（MPPs）数量。ORP100S与GM-CSF联用产生协同作用，加速中性粒细胞恢复，并保护非粒细胞系（如红细胞和血小板）。

2.6 ORP100S的药代动力学和毒理学特性

通过杂交免疫捕获液相色谱-串联质谱（LC/MS-MS） assay，测定ORP100S在小鼠和食蟹猴中的药代动力学参数。皮下给药的生物利用度为100%，半衰期为3-4小时（小鼠）和7-9小时（食蟹猴）。重复剂量急性毒理学研究显示，即使在高剂量（5120 µg，相当于80倍辐射防护剂量）下，ORP100S也未引起显著毒性或组织病理学变化。

2.7 ORP100S与rhTRX差异化调控EML细胞和癌细胞的铁死亡

铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，涉及脂质过氧化和铁积累。ORP100S在EML细胞中上调SLC7A11和GPX4表达，抑制辐射和化疗诱导的脂质过氧化和细胞内Fe²⁺积累，但在癌细胞中无此效应。rhTRX在癌细胞和正常细胞中均增强SLC7A11和GPX4表达。在EG7和B16-F10肿瘤模型中，ORP100S仅在骨髓细胞中逆转化疗引起的GPX4和SLC7A11下调。

2.8 p53是EML和癌细胞铁死亡的必要条件且受ORP100S差异化调控

ORP100S在EML细胞中抑制p53转录，但在癌细胞中无此作用。敲除p53增加所有细胞中GPX4和SLC7A11水平，但阻止rhTRX或ORP100S的进一步上调。在p53野生型SW48细胞中，化疗诱导铁死亡并可被rhTRX逆转，而ORP100S无逆转作用；在p53突变型LS1034细胞中，化疗不诱导铁死亡。ORP100S在EML细胞中通过p53报告基因 assay 显示比rhTRX更强的p53抑制活性，但在癌细胞中无效应。

2.9 ORP100S通过KLF4差异化影响p53转录

Krüppel样因子4（KLF4）是一种与p53相互作用的转录抑制因子。RNA测序分析显示，TRX敲除小鼠的HSPCs中KLF4表达降低。共免疫沉淀（Co-IP）和染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR证实TRX与KLF4结合，且KLF4结合p53基因启动子。ORP100S在EML细胞中上调KLF4表达，增强其与p53启动子的结合并抑制p53转录，但在EG7癌细胞中无此效应。过表达或敲除KLF4实验进一步验证了KLF4在ORP100S介导的p53调控中的关键作用。

3 讨论

ORP100S作为一种工程化TRX变体，克服了天然rhTRX的药理学局限性，具有更长的半衰期、更高的稳定性和选择性细胞保护功能。其通过皮下给药有效缓解辐射和化疗损伤，且在动物模型中显示无毒性。机制上，ORP100S通过KLF4-p53通路选择性抑制HSPCs铁死亡，而不影响癌细胞死亡。该研究为开发新型辐射防护剂和化疗辅助药物提供了坚实基础，尤其适用于大规模辐射暴露事件和化疗患者的多系谱血细胞保护。

4 实验方法

ORP100S通过密码子优化在大肠杆菌BL21中表达，经阴离子交换色谱和疏水相互作用色谱纯化。细胞活力采用MTT assay测定，蛋白表达通过Western blot分析，细胞内ROS和铁死亡标志物使用荧光探针检测。动物研究遵循 Duke University 和 Wake Forest University IACUC 批准 protocols。统计分析采用GraphPad Prism进行，p < 0.05视为显著。