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本研究发现色素上皮衍生因子（PEDF）缺失通过泛素-蛋白酶体途径促进星形胶质细胞谷氨酸转运体（GLT-1）降解，导致海马区谷氨酸稳态失衡和兴奋性毒性，从而诱发阿尔茨海默病（AD）样认知功能障碍。研究首次揭示PEDF通过蛋白激酶C（PKC）信号通路调控GLT-1稳定性的分子机制，为神经退行性疾病提供了新的治疗靶点。
认知功能涉及学习记忆和空间定向等心理和社会行为，对生存至关重要。阿尔茨海默病（AD）是导致认知衰退的最常见年龄相关疾病，而异常谷氨酸兴奋性是AD早期病理改变的重要风险因素。谷氨酸稳态是指细胞外谷氨酸水平的严格调控平衡，确保最佳突触功能同时防止兴奋性毒性。这一平衡通过突触前神经元释放谷氨酸、胶质细胞和神经元摄取（主要通过兴奋性氨基酸转运体）以及谷氨酸合成和回收等协调过程维持。星形胶质细胞作为主要的胶质细胞，包被大多数兴奋性突触，表达高水平的谷氨酸转运体，帮助平衡大脑中的突触谷氨酸浓度。谷氨酸转运体1（GLT-1或EAAT2）是大脑中主要的谷氨酸转运蛋白，几乎仅由星形胶质细胞表达，约占细胞外谷氨酸功能性摄取的90%。研究表明，老年人和AD患者大脑中GLT-1表达显著降低，但其调控机制尚不完全清楚。
丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPIN）超家族在多种神经退行性疾病的发生和进展中发挥重要作用。对708例前瞻性收集的尸检大脑研究发现，AD患者和症状前个体的丝氨酸蛋白酶抑制剂F1（SERPINF1）水平较低，表明SERPINF1缺陷可能是AD发病的风险因素。SERPINF1基因编码分泌性糖蛋白色素上皮衍生因子（PEDF），最初被描述为神经营养因子，是SERPIN超家族的非抑制性成员。PEDF在神经保护、发育、干细胞分化和神经发生中发挥关键作用。值得注意的是，在慢性不可预测轻度应激抑郁模型中，PEDF过表达显著降低了海马谷氨酸浓度。尽管PEDF被发现对兴奋性毒性具有神经保护作用，但大多数关于PEDF机制的研究仅限于病理条件下的细胞培养或动物模型系统。因此，PEDF在神经系统特别是星形胶质细胞中的生理功能仍知之甚少。
研究首先评估了PEDF与AD的关系。使用AlzData数据库进行的跨平台标准化分析显示，与年龄匹配的健康对照受试者相比，AD患者大脑多个区域的SERPINF1 mRNA表达水平显著降低。对NCBI基因表达 Omnibus（GEO）数据库发布的RNA测序（RNA-seq）数据集（GSE36980）的分析也显示，与健康对照相比，AD患者海马中SERPINF1减少。此外，多个GEO数据库（GSE28146、GSE29378、GSE36980、GSE48350和GSE5281）的合并分析也揭示了AD患者海马中SERPINF1表达降低。值得注意的是，对一项脑脊液（CSF）蛋白质组学研究的队列分析显示，与对照组相比，AD患者CSF中PEDF水平显著降低。
接下来，研究人员检测了66例非AD痴呆患者（30男36女）、19例AD患者（7男12女）和75例非痴呆对照受试者（34男41女）外周血中PEDF的水平。受试者的人口统计学和临床特征列于支持信息表S1中。非AD痴呆和AD患者的PEDF水平显著低于非痴呆受试者。此外，较低的血清PEDF与痴呆和AD患者的简易精神状态检查（MMSE）或蒙特利尔认知评估（MoCA）认知量表评分呈负相关。
PEDF在成年小鼠大脑中普遍表达，包括小脑（CB）、髓质（MY）、丘脑（TH）、嗅皮质区域（OLF）和海马（HPF）。Western印迹（WB）显示，与野生型对照相比，6月龄APP/PS1小鼠和8周龄5×FAD模型小鼠海马中PEDF显著下调。这些数据表明，PEDF水平降低可能是AD的风险因素。
为了研究删除SERPINF1的潜在影响和AD相关表型，研究人员构建了全身性serpinf1缺失小鼠系（图2A）。Serpinf1敲除（KO）小鼠表现出正常的体型和脑重（图S2A，B）。在验证海马PEDF水平几乎完全降低后（图S2C-F），研究人员调查了KO小鼠和WT对照的行为表现。在旷场试验（OFT）中未观察到一般运动差异（图S2G-M）。KO小鼠在9月龄时在新物体识别（NOR）测试中表现出物体识别缺陷（图2B-D），但在12月龄时在莫里斯水迷宫（MWM）或恐惧条件反射（FC）中未表现出空间记忆缺陷（图S2N-U）。然而，KO小鼠在15月龄时在MWM和Y迷宫任务中表现出空间参考学习缺陷（图2E-J；图S3A-D），并在18月龄时在MWM和Y迷宫任务中表现受损（图S3E-N）。
接下来，对9月龄KO和WT小鼠海马组织RNA-seq数据的主成分分析（PCA）表明基因表达模式存在显著差异。这些差异得到差异表达基因（DEG）聚类热图的进一步支持（图2K）。值得注意的是，DEG的京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA）通路富集分析显示，神经退行性疾病相关基因和通路高度富集，阿尔茨海默病是排名最高的富集疾病类型（图2L；图S3O）。基因本体（GO）通路分析中生物过程（BP）类别的GSEA分析表明，与认知功能以及学习和记忆相关的术语显著抑制（图S3P）。随后，将DEG编码的前50个蛋白质进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络功能富集分析，使用STRING数据库，进一步的KEGG通路富集分析显示这些蛋白质显著富集于AD发展（图S3Q和表S2）。此外，使用AD患者海马基因表达数据集（GSE48350）与当前研究中确定的DEG进行比较（图S3R）。这些数据表明PEDF缺陷诱导了年龄相关认知衰退和AD样表型。
为了确定PEDF缺陷是否加剧AD病理行为表现的进展并阐明PEDF在AD中的功能，研究人员将serpinf1-/-小鼠与5×FAD小鼠杂交（图3A；图S4A-G）。8周龄serpinf1-/- 5×FAD小鼠在NOR中表现出认知功能受损（图S4H-J），在MWM中空间学习记忆受损（图3B-F；图S4O），在Y迷宫任务中短期工作记忆受损（图S3K-N）。
接下来，为了研究在海马中过表达PEDF的后果，研究人员将AAV-serpinf1或AAV-con病毒注入6月龄APP/PS1小鼠海马CA1区（图3G-H；图S4P）。在OFT中，感染AAV-serpinf1的APP/PS1小鼠在CA1中未观察到行为变化（图S4Q-T）。然而，感染AAV-serpinf1的小鼠在NOR中对新物体的记忆改善（图S3U-W），在MWM中空间学习记忆更好（图3I-M；图S4b），在Y迷宫任务中工作记忆更好（图S4X-a）。这些数据表明，PEDF表达减少加剧了AD小鼠模型的行为异常，而PEDF过发挥保护作用。
接下来，研究人员研究了PEDF调节AD样行为的潜在机制。从serpinf1-/-和WT小鼠的RNA-seq分析中富集了三个不同类别：BP、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。在BP类别中，包括神经递质运输、神经递质摄取和再摄取在内的突触相关过程在serpinf1-/-小鼠中富集（图4A；图S5A）。值得注意的是，在CC类别的GSEA分析中，谷氨酸能突触在serpinf1-/-小鼠中显著富集（图4B）。
为了确认从GO功能富集分析中获得的证据，研究人员检测了与谷氨酸-谷氨酰胺循环相关的关键蛋白水平，该循环与神经递质（主要是谷氨酸）摄取和再摄取功能有关（图4C）。WB显示，与WT对照相比，6月龄serpinf1-/-小鼠海马中GLT-1显著降低。然而，serpinf1-/-小鼠中L-谷氨酸-L-天冬氨酸转运体（GLAST，也称为EAAT1）、谷氨酰胺合成酶（GS）或兴奋性氨基酸载体1（EAAC1，也称为EAAT3）的水平没有显著变化（图4D）。免疫荧光（IF）染色证明，serpinf1-/-小鼠海马CA1区GLT-1的荧光强度显著低于WT对照（图S5C）。研究人员还在18月龄serpinf1-/-和WT小鼠中重复了上述实验（图S5B-D）。
GLT-1主要在星形胶质细胞中表达，一小部分也在神经元轴突末端表达（图4C）。WB显示，GLT-1在培养的星形胶质细胞中显著降低，但在神经元中没有（图4E）。此外，IF染色证明，与WT对照相比，serpinf1-/-星形胶质细胞中GLT-1阳性区域显著 smaller（图4F）。
当用重组小鼠源性PEDF蛋白（rmPEDF）处理时，WB显示，在浓度高于25 ng mL-1（小鼠生理浓度：5 ng mL-1，人类的1/1000）时，GLT-1表达以浓度依赖性方式增加，无论是在原代星形胶质细胞（图4G；图S5E）还是C6细胞系中（图S5H）。IF染色证实，用rmPEDF处理后，来自serpinf1-/-小鼠的GFAP标记的星形胶质细胞表达更高水平的GLT-1（图4H）。
此外，WB分析证实了在用pcDNA3.1+作为载体的PEDF过表达质粒转染的原代星形胶质细胞（图S5F,G）或C6细胞系（图S5I）中GLT-1过表达。此外，WB和IF染色分析显示，在用针对PEDF的小干扰RNA（si-serpinf1）转染的原代星形胶质细胞中，GLT-1表达显著降低（图4I；图S5J,K）。总的来说，这些结果表明PEDF调节海马星形胶质细胞GLT-1的表达。
在WT星形胶质细胞中，4小时后谷氨酸浓度降低了近50%，而serpinf1-/-星形胶质细胞的谷氨酸摄取能力显著受损（图5A）。此外，serpinf1-/-星形胶质细胞的细胞内谷氨酸浓度显著低于WT星形胶质细胞，表明KO星形胶质细胞具有较低的谷氨酸摄取能力（图5B）。此外，用PEDF过表达腺病毒转染改善了C6的谷氨酸摄取能力，但不改变谷氨酸释放（图S6A-E）。
接下来，将AAV-iGluSnFR病毒注入6月龄serpinf1-/-和WT小鼠海马，并在感染后20天获得急性海马切片，通过双光子显微镜观察（图5C-E）。谷氨酸信号分析显示，serpinf1-/-小鼠在缺氧刺激后表现出比WT小鼠更高的基线和最大谷氨酸信号（图5E-G）。尽管serpinf1-/-小鼠表现出比WT对照小鼠更高的谷氨酸释放，但差异不显著（图5H）。此外，在8周龄5×FAD小鼠与serpinf1-/- 5×FAD小鼠杂交的后代中获得了一致的结果（图S6F-I）。
Serpinf1-/-小鼠表现出比WT对照显著更低的微型兴奋性突触后电流（mEPSC）频率和振幅（图5I-K）。此外，serpinf1-/-小鼠中单个mEPSC的衰减时间延长，表明突触中谷氨酸清除时间更长（图5L,M）。这些结果表明PEDF表达减少破坏了基础谷氨酸能突触传递，这一现象与在谷氨酸能突触蛋白水平观察到的改变一致，包括囊泡谷氨酸转运体1（VGlut1）（图S6J）。此外，serpinf1-/-小鼠中的GABA能突触似乎未受影响（图S6K）。此外，serpinf1-/-小鼠在6月龄时表现出星形胶质细胞的异常激活，并且激活水平随着年龄增长而逐渐恶化，而在serpinf1-/-小鼠中未观察到小胶质细胞数量或活性状态的显著变化（图S6L-N）。
值得注意的是，突触谷氨酸清除受损先前已被认为与癫痫发作易感性有关。正如预期的那样，腹腔注射单次阈下剂量2 mg kg-1红藻氨酸（KA）在WT对照小鼠中未引起任何癫痫发作相关反应。然而，大多数KO小鼠在注射后30-40分钟早期出现阵挛性发作（图S6O）。因此，这些数据证实PEDF缺失导致海马突触功能改变。
神经元调整其树突生长和分支以补偿突触传递的变化，这些过程称为结构稳态。先前的报告表明，异常高水平的细胞外谷氨酸导致树突萎缩和脊柱丢失。Sholl分析 after Golgi染色证实，6月龄serpinf1-/-小鼠CA1神经元树突复杂性和树突棘密度降低（图6A-D），并在18月龄时减少更显著（图S7A-D）。
长时程增强（LTP）被认为是学习记忆的神经基础。因此，研究人员记录了serpinf1-/-和WT小鼠Schaffer侧支（SC）CA1通路LTP。基于30分钟场兴奋性突触后电位（fEPSP）基线记录，与高频刺激（HFS）后前10分钟和最后10分钟比较，9月龄WT小鼠诱导了正常的LTP。相比之下，serpinf1-/-小鼠表现出HFS诱导的LTP受损（图6E-F）。先前的研究表明，海马SC-CA1中的LTP依赖于N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）介导的兴奋性突触后电流（EPSC）。相应地，CA1锥体神经元的全细胞记录显示，6月龄serpinf1-/-小鼠神经元中NMDAR介导的EPSC振幅显著 smaller than WT对照（图S7E,F）。WB证实serpinf1-/-小鼠海马中突触素和突触后密度蛋白95（PSD-95）水平降低。（图6G）。
星形胶质细胞GLT-1水平降低可能升高突触处谷氨酸浓度，随后通过NMDAR介导的细胞内Ca2+增加引发兴奋性毒性细胞死亡。尼氏染色未揭示6、9和12月龄serpinf1-/-小鼠海马CA1区任何显著差异。然而，与WT对照相比，15月龄serpinf1-/-小鼠神经元丢失显著 greater（图S7G），到18月龄时，serpinf1-/-在海马其他区域包括CA3和DG表现出显著的神经元丢失（图S7H）。此外，serpinf1-/- 5×FAD小鼠也表现出比5×FAD小鼠显著 greater的神经元丢失（图S8A）。相反，在6月龄时将AAV-serpinf1注入APP/PS1小鼠海马CA1减轻了神经元丢失（图S8B）。
谷氨酸转运体表达的变化已被确定发生在AD的早期阶段，这表明功能失调的谷氨酸运输可能是该疾病病理的早期事件。有趣的是，谷氨酸和淀粉样β已被证明相互影响。除了影响淀粉样β产生外，有证据表明谷氨酸和淀粉样β之间的相互作用影响tau磷酸化。IF染色显示，6月龄serpinf1-/-小鼠中淀粉样β产生和tau磷酸化均未显著改变（图S8C-E）。然而，在18月龄时，与WT对照相比，serpinf1-/-小鼠海马中可溶性淀粉样β和tau磷酸化均显著增加（图S8F-H）。值得注意的是，AAV-serpinf1处理导致APP/PS1小鼠海马CA1区淀粉样β沉积显著减少，如硫黄素-T（Th T）染色所证明（图S8I）。一致地，它也显著减弱了磷酸化tau水平（图S9A-C）。总之，这些数据表明PEDF耗竭通过减少星形胶质细胞GLT-1表达增加了AD早期阶段突触处谷氨酸浓度，这些变化显著促进了AD病理的年龄相关进展，包括受损的突触可塑性、神经元丢失、淀粉样β产生和tau磷酸化。
为了研究PEDF缺陷降低星形胶质细胞GLT-1表达的机制，研究人员通过RT-qPCR量化了从serpinf1-/-和WT小鼠分离的海马组织和原代星形胶质细胞中Slc1a2 mRNA（GLT-1的基因名称）。与先前对serpinf1-/-和WT小鼠海马组织的RNA-seq分析一致，PEDF缺陷不在转录水平上调节星形胶质细胞GLT-1（图7A）。值得注意的是，来自RNA-seq分析的CC类别的GSEA分析表明，泛素依赖性蛋白酶体降解通路在serpinf1-/-小鼠海马中显著激活（图7B；图S10A）。
GLT-1是一种相对稳定的蛋白质。然而，GLT-1可以被泛素化和被蛋白酶体降解，用蛋白酶体抑制剂MG132处理星形胶质细胞提高了GLT-1水平。GLT-1的异常泛素化被报道降低星形胶质细胞中GLT-1蛋白表达和谷氨酸摄取。相应地，研究人员用放线菌酮（CHX）抑制蛋白质合成，以检查C6细胞中GLT-1的半衰期。随着CHX处理时间的增加，GLT-1的蛋白质水平显著降低。然而，这些效应通过添加MG132部分挽救，GLT-1的半衰期估计约为12小时（图S10B）。在用CHX处理12和24小时的原代星形胶质细胞中观察到相似趋势（图7C）。结果显示，与si-NC细胞相比，si-serpinf1细胞中GLT-1蛋白水平较低，然而，si-serpinf1细胞中GLT-1的减少通过添加MG132显著缓解，表明PEDF缺陷增强了GLT-1的蛋白酶体降解（图7D）。此外，免疫共沉淀（Co-IP）分析显示，在原代星形胶质细胞上敲低PEDF表达后，泛素结合GLT-1显著增加（图7E）。相反，在用CHX预处理24小时的原代星形胶质细胞中，研究人员观察到用rmPEDF处理后GLT-1蛋白表达显著升高，这表明PEDF的存在减弱了GLT-1的降解（图S10C）。平行地，Co-IP测定证明，用rmPEDF处理原代星形胶质细胞显著减少了泛素结合GLT-1（图S10D）。
GLT-1的泛素化与蛋白激酶C alpha（PKCα）的激活密切相关。值得注意的是，在我们先前的RNA-seq分析中，MF类别的GSEA分析揭示了serpinf1-/-小鼠中PKC激活增加（图7B）。因此，为了检查GLT-1和PKCα磷酸化之间的相互作用，研究人员进行了磷酸化PKCα（Thr638）的WB。与WT对照相比，从serpinf1-/-小鼠海马提取的原代P0星形胶质细胞中PKCα显著激活（图7F）。随后，收集培养的星形胶质细胞，用GLT-1免疫沉淀，并用pan-丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化和GLT-1抗体进行印迹。Co-IP测定显示，在用si-serpinf1转染的细胞中，磷酸化GLT-1水平较高，输入组显示磷酸化PKCα（Thr638）显著增加，这表明PKCα激活可能导致GLT-1磷酸化（图7G）。此外，在用si-serpinf1转染的细胞中使用PKC抑制剂α Ro-31-8220抑制PKCα激活增加了GLT-1的表达（图7H）。作为进一步反向验证，用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（PKCα激动剂）处理证实，PKCα激活显著降低了星形胶质细胞中GLT-1的表达。然而，用rmPEDF处理显著 alleviated 了使用PMA激活PKCα引起的GLT-1表达减少（图7I）。IF染色显示，用PMA处理降低了星形胶质细胞中GLT-1表达，并且这种效应可以通过添加rmPEDF挽救（图S10E）。有趣的是，serpinf1-/-小鼠和WT对照海马中PKCα表达没有显著差异。然而，serpinf1-/-小鼠中磷酸化PKCα水平显著更高，表明缺乏PEDF可能内源性激活PKCα（图S10F）。
为了初步研究PEDF抑制PKCα激活的通路，研究人员调查了PEDF的结构。先前的研究报道，PEDF的神经保护功能源自一个包含44个氨基酸的肽（Val78-Thr121），它作为配体并结合PEDF受体（PEDF-R，也称为脂肪甘油三酯脂肪酶，ATGL；由PNPLA2基因编码）（图S10G）。因此，研究人员首先研究了小鼠大脑中PEDF-R的基础水平，发现PEDF-R在海马中高表达（图S10H）。PEDF-R作为一种具有酯酶功能的ATGL，降解甘油三酯产生二酰基甘油（DAG），后者可以增加PKC活性。研究人员未观察到serpinf1-/-和WT小鼠原代星形胶质细胞中DAG表达的任何显著差异（图S10I）。因此，研究人员使用小干扰RNA（si-pnpla2）敲低C6细胞中的PEDF-R，这增加了PKCα的磷酸化，并且rmPEDF对PKCα磷酸化的抑制被阻断（图S10J-L）。值得注意的是，PEDF-R在与PEDF结合后可以发挥钙非依赖性磷脂酶A2（iPLA2）活性，刺激从细胞膜磷脂释放二十二碳六烯酸（DHA），而DHA已被报道抑制PKCα活性。与这些报告一致，使用si-pnpla2敲低C6细胞中的PEDF-R导致DHA水平显著降低（图S10M）。这些数据表明PEDF缺陷可能通过阻断PEDF-R/iPLA2/DHA通路促进PKCα磷酸化，从而增加GLT-1的泛素蛋白酶体降解。
如果GLT-1表达降低是serpinf1-/-小鼠认知衰退的主要原因，研究人员假设增加GLT-1表达可能会改善空间学习和短期工作记忆。研究人员向15月龄serpinf1-/-小鼠注射盐水或头孢曲松（CEF），一种β-内酰胺抗生素，据报道通过上调GLT-1转录发挥神经保护作用，持续5天并进行认知记忆行为测试（图S11A）。在Y迷宫测试中，接受CEF的serpinf1-/-小鼠花费更多时间探索新臂，表明CEF改善了它们的短期工作记忆，尽管效果不显著（图S11B-E）。在MWM测试中，注射CEF的serpinf1-/-小鼠在逃避潜伏期表现出更好的学习曲线，并在测试阶段对平台位置的记忆改善（图S11F-K），并在注射基础的恐惧条件反射测试中改善情境记忆（图S11L-N）。CEF注射显著增加了海马组织中GLT-1的mRNA和蛋白质水平。然而，注射CEF的serpinf1-/-小鼠中GLT-1蛋白水平仍然显著低于注射盐水的WT小鼠，这表明CEF可能通过其他效应改善了serpinf1-/-小鼠的行为表现（图S11O,P）。尼氏染色显示，用CEF处理的serpinf1-/-正常神经元数量有增加趋势。然而，与serpinf1-/-盐水小鼠相比，这种效应不显著（图S11Q）。
由于CEF治疗效果有限且难以排除其作为抗生素的其他作用机制的影响，研究人员使用了LDN-212320（也称为OSU-212320），一种小分子激动剂，据报道通过增加GLT-1翻译延长肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型的寿命，发挥神经保护功能。研究人员向serpinf1-/-小鼠注射20 mg/kg LDN-212320或载体，持续10天，并评估认知记忆行为（图8A）。在NOR中，LDN-212320处理的小鼠对新物体的探索时间显著更长，识别能力更好，表明LDN-212320改善了serpinf1-/-小鼠的认知功能（图8B-D）。类似地，LDN-212320显著改善了serpinf1-/-小鼠在Y迷宫测试中对新旧臂的辨别（图S12A-D）。在MWM任务中，LDN-212320处理的serpinf1-/-
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