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本文揭示了胰腺导管腺癌（PDAC）中上皮细胞（EPC）分泌的SPP1通过结合间质细胞（MPC）表面受体CD61（Itgb3），激活NF-κB通路并诱导BMP2/GREM1表达，从而形成双向旁分泌调控环路，决定细胞命运并影响肿瘤进展与转移。该发现为靶向肿瘤异质性提供了新策略。
胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的主要原因之一，其五年相对生存率仅为13%。肿瘤细胞间通讯网络的复杂性对理解细胞命运决策和PDAC进展至关重要。先前研究表明，间质PDAC细胞（MPC）分泌的BMP拮抗剂GREM1通过持续抑制BMP活性对维持上皮PDAC细胞（EPC）命运至关重要。本研究发现SPP1（也称为骨桥蛋白）是胰腺癌中维持间质细胞命运的关键调节因子。对PDAC患者血浆的蛋白质组学分析显示，SPP1在晚期疾病中显著上调。在小鼠PDAC模型中，Spp1的失活导致肿瘤发生延迟并消除了转移形成。Spp1在上皮PDAC细胞中表达，其失活导致间质向上皮PDAC细胞的转化。在机制上，SPP1与间质PDAC细胞上的CD61受体结合，诱导Bmp2和Grem1表达，而GREM1对BMP信号的抑制是上皮细胞中Spp1表达所必需的，从而形成了一个细胞间调控环路。Grem1的 concomitant 失活将Spp1敲除的上皮表型逆转为完全间质的PDAC。相反，Grem1杂合性结合Spp1敲除导致了野生型PDAC组织学，这一结果证实了这些因子的直接拮抗功能。因此，间质和上皮PDAC细胞命运由可溶性因子GREM1和SPP1的相互旁分泌调节决定。
为了识别控制胰腺癌进展的因子，研究比较了早期（I或II期）或晚期（III或IV期）PDAC患者血浆中的蛋白质水平。SPP1的丰度在晚期显著增加。在常用的PDAC小鼠模型KPCY（Pdx1-cre;KrasLSL-G12D/+;Trp53fl/fl;Rosa26LSL-YFP）小鼠中，SPP1血浆水平也较野生型（WT）动物增加。对公共数据库的单细胞测序数据分析显示，SPP1高表达的癌细胞群体具有显著更高的上皮-间质转化（EMT）特征基因水平。对644名胰腺癌患者的转录组数据分析发现，SPP1高表达患者显示出 hallmark EMT 基因集的显著富集，且预后更差。这些结果表明SPP1是胰腺癌EMT的调节因子。
对KPCY肿瘤的免疫荧光染色显示，SPP1主要在上皮PDAC细胞（EPC）中表达，而不在波形蛋白（VIM）阳性的间质PDAC细胞（MPC）中表达。为了理解SPP1功能，研究从Pdx1-Flp;KrasFSF-G12D/+;Trp53frt/frt;Vim-GFP（KPFV）小鼠的肿瘤建立了类器官，该系统能够基于GFP荧光区分EPC和MPC。使用CRISPR–Cas9技术在KPFV类器官中进行Spp1敲除。VIM–GFP+ MPC群体在Spp1敲除后被消除。定量PCR与逆转录（RT–qPCR）分析显示间质标志物Vim、Fn1和S100a4的表达显著降低，同时上皮标志物Krt19、Cdh1和Epcam显著增加。与此结果一致，来自缺乏SPP1的KPF（Pdx1-Flp;KrasFSF-G12D/+;Trp53frt/frt）类器官产生的同种移植肿瘤更少且体积小，几乎完全由EPC组成。相反，来自对照KPF类器官形成的肿瘤包含EPC和MPC群体。此外，在来自KPR172H/+C（LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre）小鼠的类器官中过表达Spp1诱导了PDAC细胞的间质分化。值得注意的是，这些表型在敲除或过表达SPP1的人PDAC类器官和异种移植瘤中也观察到。因此，EPC产生的SPP1是小鼠和人类PDAC中MPC维持所必需的。
几个受体被鉴定为SPP1的受体，包括整合素CD61（由Itgb3编码）。KPCY肿瘤的免疫荧光染色显示SPP1和CD61的表达模式显著互补，CD61主要在MPC中表达。为了进一步研究SPP1和CD61之间的关系，在KPFV类器官中使用CRISPR–Cas9介导敲除Itgb3。在Itgb3缺陷的KPFV类器官中未观察到VIM–GFP+细胞，其间质标志物表达也显著降低。此外，同种移植瘤形成显著减少，且Itgb3缺陷同种移植瘤中MPC比例降低。因此，Itgb3敲除模拟了Spp1敲除的表型，这一结果强烈表明SPP1通过CD61发挥作用。
研究接下来调查了SPP1在PDAC进展中的潜在功能。将Flp/Frt重组系统诱导的PDAC（KPF小鼠）与floxed Spp1（Spp1fl）等位基因、Flp诱导的Rosa26FSF-creER等位基因（允许在肿瘤发展期间删除胰腺实质中的Spp1）和Tomato/GFP-Cre报告等位基因组合，生成复合Pdx1-Flp;KrasFSF-G12D/+;Trp53frt/frt;R26FSF-creER;R26mTmG;Spp1fl/fl（Spp1fl/fl KPFCT）小鼠。对25天大的动物给予他莫昔芬以在PDAC肿瘤中灭活Spp1。Spp1缺陷肿瘤的组织学显示上皮结构显著增加，免疫荧光分析显示PDAC肿瘤中包含显著增加的EPC（KRT19+VIM–）和显著减少的MPC（KRT19–VIM+）。值得注意的是，Spp1fl/fl KPFCT肿瘤显示癌症相关成纤维细胞显著减少。然而，尽管癌症相关成纤维细胞减少，免疫浸润程度未改变。MPC增加是导致PDAC患者预后不良的关键因素。相应地，携带肿瘤的Spp1fl/fl KPFCT小鼠与对照KPFCT小鼠相比生存期显著延长。此外，在KPCY模型中，Spp1的缺失也显著减少了PDAC发展，相当比例的Spp1缺陷动物存活超过400天。
EMT是肿瘤转移形成的重要机制。为了研究Spp1对PDAC转移的影响，使用了KPhetFCT（Pdx1-Flp;KrasFSF-G12D/+;Trp53WT/frt;R26FSF-creER;R26mTmG）小鼠，因为Trp53的杂合性意味着肿瘤形成具有更长的潜伏期，这使得转移能够形成和传播。超声成像显示大多数小鼠在大约100天龄时出现肿瘤。因此，在此时间点给予他莫昔芬，并监测肿瘤进展和转移形成。与Spp1fl/fl KPFCT小鼠一致，Spp1fl/fl KPhetFCT小鼠（敲除Spp1）的肿瘤主要由EPC组成，而KPhetFCT小鼠（WT Spp1）形成包含EPC和MPC的肿瘤。在KPhetFCT小鼠中，23%的动物检测到肝转移，30%有肺转移。相比之下，Spp1fl/fl KPhetFCT小鼠肝脏或肺部均无转移。此外，Spp1过表达KPR172H/+C类器官的 orthotopic 移植显著促进了肝和肺转移。相反，体内给予SPP1阻断抗体减少了MPC细胞命运并抑制了肝和肺转移。这些数据共同证明SPP1对于维持MPC命运和促进转移形成至关重要。
研究接下来试图研究SPP1功能的分子机制。先前研究将Grem1鉴定为BMP2靶基因以控制上皮细胞身份。对Spp1Δ/Δ KPFV和对照类器官的RNA测序（RNA-seq）分析显示SPP1功能是Bmp2和Grem1表达所必需的，这一结果通过RT–qPCR得到确认。类似地，Itgb3敲除显著减弱了Bmp2和Grem1表达。相反，过表达Itgb3增加了Bmp2和Grem1表达。这一结果表明信号轴SPP1–CD61–BMP2–GREM1在EPC和MPC PDAC亚群之间运作。
RNA-seq分析显示Itgb3敲除类器官表现出受损的NF-κB信号。RT–qPCR证实NF-κB靶基因Ccl2、Clap2和Tnf的下调，而它们的表达在Itgb3过表达时增加。接下来，使用JASPAR数据库，在Bmp2启动子中鉴定出两个推定的NF-κB结合位点，并且对RelA的染色质免疫沉淀 assay 证实了与Bmp2启动子中这两个位点的结合。TAK1激酶抑制剂5Z-7-oxozeaenol显著抑制了RelA与+1597位点的结合并降低了Bmp2 mRNA水平。因此，SPP1通过激活NF-κB信号通路诱导Bmp2表达，并间接诱导BMP2靶基因Grem1的表达。
BMP2处理增加了Bmp2表达，表明存在一个自动调节反馈环路，并且还上调了Grem1但降低了Spp1表达。BMP2处理导致BMP靶基因Id1、Id2和Id3的快速诱导，但Spp1下调仅在24小时后发生并与Vim表达增加同时发生。相反，用BMP抑制剂LDN193189处理导致相反效果。这表明Spp1是上皮身份的结果而表达。因此，BMP2、SPP1和GREM1是决定PDAC细胞命运的复杂调控环路的组成部分。
为了更好地理解PDAC细胞命运决定的机制，生成了Spp1和Grem1复合双敲除模型。Grem1的 concomitant 失活将Spp1敲除的上皮表型逆转为完全间质的PDAC。此外，Grem1杂合性结合Spp1敲除导致了WT PDAC组织学，这一结果突出了它们的直接 opposing 功能。此外，随后的Grem1敲除逆转了Spp1敲除的效果并产生了间质表型。相反，Grem1过表达逆转了Spp1过表达的效果并诱导了上皮表型。这些结果进一步强调了SPP1和GREM1之间的拮抗关系。
细胞异质性是用于胰腺癌分类的一个显著特征。本研究显示上皮和间质PDAC亚群通过三种可扩散分子SPP1、BMP2和GREM1的相互旁分泌信号网络相互维持。推测上皮和间质亚群的相互依赖性可能是PDAC中 obligatory 细胞异质性的基础。此外，数据表明细胞异质性是高效胰腺肿瘤形成所必需的，因为通过Spp1失活减少间质PDAC亚群导致侵袭性KPF和KPC PDAC模型中的寿命显著延长。因此，旨在减少细胞异质性的治疗策略可考虑用于PDAC治疗。
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