核糖核苷酸渗入线粒体DNA驱动炎症反应——揭示核苷酸代谢失衡引发年龄相关性炎症的新机制

本研究揭示了核苷酸代谢失衡导致核糖核苷酸误掺入线粒体DNA，引发mtDNA片段释放至胞质，通过cGAS-STING通路激活天然免疫反应和衰老相关分泌表型（SASP）。研究人员通过MGME1缺失小鼠模型、细胞衰老模型及多种分子生物学技术，证实核糖核苷酸/脱氧核糖核苷酸（rNTP/dNTP）比例升高是驱动线粒体基因组不稳定性及年龄相关性炎症的关键机制，为治疗mtDNA相关炎症疾病提供了新靶点。

代谢紊乱与炎症反应密切相关，但核苷酸缺乏如何驱动线粒体DNA（mtDNA）依赖性炎症的具体机制尚未明确。线粒体作为细胞能量工厂和信号枢纽，其功能异常会引发炎症、细胞死亡和疾病。多种应激因素（如病原体感染、mtDNA包装缺陷、嘧啶代谢障碍等）可导致mtDNA释放到胞质，通过cGAS-STING-TBK1信号通路激活I型干扰素和干扰素刺激基因（ISGs）表达。这一反应虽有助于抗病原体防御，但过度激活会促进自身免疫病、炎症性疾病及衰老进程。

近期研究表明，线粒体蛋白酶YME1L通过重塑线粒体蛋白质组响应营养应激，支持回补反应和嘧啶代谢，对某些实体瘤生长和成体神经干细胞维持至关重要。YME1L缺失或化疗药物抑制胞质嘧啶合成会引发核苷酸失衡，导致mtDNA释放和炎症。然而，核苷酸失衡或其他线粒体应激源影响mtDNA并导致其释放的具体机制仍不清楚。

本研究团队发现，缺乏线粒体核酸酶MGME1的小鼠（Mgme1^-/-）在约1岁时出现肾脏炎症并过早死于肾衰竭。为探究线粒体依赖性先天免疫信号是否参与该表型，研究人员监测了不同年龄野生型（WT）和Mgme1^-/-小鼠肾脏中ISGs的mRNA水平。结果显示，随着衰老进程，Mgme1^-/-小鼠ISG表达逐渐诱导，70周龄时达到最高。该反应具有组织特异性，在55周龄Mgme1^-/-小鼠的脾脏、心脏、肝脏或脑组织中未观察到类似现象。

通过分离55周龄小鼠肾脏线粒体和胞质组分，并采用针对mtDNA控制区、大弧和小弧的特异性探针进行数字PCR（dPCR）分析，发现Mgme1^-/-肾脏胞质中存在mtDNA，且这些片段主要富集于重链复制起点（O_H）附近区域。肝脏胞质中也可检测到mtDNA片段，但水平较低，与肝脏缺乏炎症的现象一致。这可能是因为3'修复核酸酶1（TREX1）等胞质DNA清除机制在低水平mtDNA释放时足以预防天然免疫反应激活。

为验证胞质mtDNA片段是否通过cGAS-STING-TBK1信号通路触发炎症反应，研究人员将Mgme1^-/-小鼠与携带功能缺失突变Sting1^mut/mut（编码STING）的小鼠杂交，获得双敲除（DKO）小鼠。55周龄Mgme1^-/-小鼠肾脏中强烈的ISG反应在STING缺失后显著减弱，表明STING在体内炎症反应中起关键作用。组织学分析显示，STING消融改善了Mgme1^-/-小鼠的肾脏表型，包括肾小球硬化、蛋白管型形成及B220⁺和CD3⁺T细胞的肾周浸润。

在细胞模型中，Mgme1^-/-原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）表现出显著ISG反应，STING1缺失后该反应被强烈抑制。消耗cGAS或STING，或用BX795抑制TBK1，可抑制永生化Mgme1^-/-细胞中ISG表达，而RNA传感器的缺失无此效应。此外，基础条件下主要位于核内的cGAS在Mgme1^-/-细胞胞质中积累。数字液滴PCR（ddPCR）和细胞分馏实验检测到Mgme1^-/- MEFs胞质mtDNA水平增加，免疫荧光显微镜显示胞质DNA焦点数量和细胞比例升高。用链终止核苷酸类似物2',3'-双脱氧胞苷（ddC）消耗mtDNA后，MGME1缺失或Mgme1缺陷细胞中的天然免疫信号被抑制。这些实验证明MGME1缺失导致mtDNA释放到胞质，激活cGAS-STING-TBK1信号和ISGs表达。

由于MGME1作为线粒体复制核酸酶的功能，研究人员推测受损的mtDNA复制可能触发mtDNA依赖性免疫反应。但与其他mtDNA复制酶（如Polrmt、Rnasch1）缺失不同，Mgme1^-/-细胞中ISG反应依然存在。相反，消耗解旋酶Twinkle或Ssbp1可抑制Mgme1^-/-细胞中的ISG反应，表明持续的mtDNA合成是触发mtDNA释放所必需的。

对Mgme1^-/-小鼠肾脏mtDNA进行测序，发现随距离O_H增加，序列覆盖率下降，与之前脑和心脏组织中的复制停滞表型一致。深度测序分析提示Mgme1^-/-肾脏中从O_H起始的mtDNA复制事件增多，这可能解释mtDNA依赖性炎症的组织特异性。增加的复制起始可能导致脱氧核苷酸池耗竭，引起细胞核苷酸失衡和mtDNA依赖性天然免疫信号传导。

通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析Mgme1^-/-细胞核苷酸水平，发现脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）降低，核糖核苷酸单磷酸（rNMPs）显著增加。消耗SAMHD1（一种脱氧核苷酸三磷酸三磷酸水解酶）可恢复dNTP水平并抑制ISG反应。消耗线粒体嘧啶核苷酸载体SLC25A33（支持mtDNA复制的嘧啶核苷酸线粒体摄取载体）也可降低Mgme1^-/-细胞中的ISG表达。这些结果表明，核苷酸代谢紊乱 combined with altered mtDNA replication triggers mtDNA release and cGAS-STING-TBK1 signalling in Mgme1^-/- cells.

研究人员进一步发现，Mgme1^-/-细胞中核糖核苷酸三磷酸（rNTP）与dNTP的比率升高。YME1L缺失和用5-氟尿嘧啶（5-FU）抑制胞质胸苷酸合酶（均已知可触发mtDNA依赖性天然免疫信号）也增加rNTP/dNTP比率。真核细胞中rNTP相对于dNTP过量存在，尽管复制聚合酶对dNTP高度选择，但rNTP的错误掺入可能挑战DNA复制，导致DNA链断裂、基因组不稳定和自身免疫疾病。核糖核苷酸切除修复（涉及RNase H2）限制了核DNA中的rNMP含量，但线粒体中缺乏清除核糖核苷酸的机制，使mtDNA易受rNTP掺入影响。

通过水解末端测序（HydEn-seq）和碱性凝胶电泳分析，直接定量了WT和Yme1l^-/-细胞mtDNA中的rNMP含量。结果显示Yme1l^-/-细胞重链中鸟嘌呤核糖核苷酸相对增加。碱性条件下，Yme1l^-/-细胞mtDNA显示不同的降解模式和更短DNA片段形成，表明对碱性的敏感性增加，提示rNTP掺入增多。Mgme1^-/-细胞中也观察到类似现象，重链中鸟嘌呤核糖核苷酸水平显著更高，轻链中胞苷核糖核苷酸插入增加，两条链中腺苷核糖核苷酸掺入减少。55周龄Mgme1^-/-小鼠肾脏mtDNA对碱性和RNase H2处理敏感性增加，表明体内mtDNA rNMP含量升高。

在细胞衰老模型中，研究人员用羟基脲（HU）（胞质核糖核苷酸还原酶（RNR）的有效抑制剂）处理WT细胞，也观察到mtDNA rNMP含量增加。RNR由两个非同源亚基RRM1和RRM2组成，RRM2表达呈细胞周期依赖性，在细胞周期停滞的衰老细胞中停止，导致dNTP水平降低。由于mtDNA释放有助于衰老细胞的促炎SASP，且mtDNA复制与细胞周期无关，研究人员推测改变的rNTP/dNTP比率和增加的rNTP掺入mtDNA可能触发衰老细胞中的mtDNA释放和SASP。

通过电离辐射（IR）或治疗诱导衰老（TIS）处理人肺IMR90成纤维细胞，研究人员证实衰老状态的建立（通过SA-β-gal活性和衰老相关蛋白标志物变化验证）。代谢组学分析显示IR或TIS后rNTP/dNTP比率增加。碱性凝胶电泳分析显示IR处理后衰老细胞mtDNA对碱性和RNase H2处理敏感性增加，表明这些细胞mtDNA的rNMP含量更高。在地西他滨或多柔比星处理的衰老IMR90成纤维细胞及照射后的肾近端小管上皮细胞中也观察到类似现象。

为验证mtDNA rNMP含量增加是否影响mtDNA释放和SASP，研究人员用脱氧核糖核苷补充衰老细胞。脱氧核糖核苷补充不影响衰老状态本身，但显著减少胞质mtDNA和mtDNA对碱及RNase H2处理的敏感性，表明rNMP含量降低。dNTP补充衰老细胞后，rNTP掺入减少，炎症性SASP基因表达被抑制。这表明SASP基因表达依赖于衰老细胞mtDNA中rNTP掺入的增加。

在自然衰老过程中，研究人员对老年小鼠肾脏、肝脏、心脏和脾脏进行代谢组学分析，发现所有组织中rNTP/dNTP比率均增加，且对不同核苷酸有多样化影响。从这些组织分离的mtDNA对碱性和RNase H2处理的敏感性较年轻小鼠增加，证明老年组织中rNTP掺入增加。

本研究使用的主要技术方法包括：基因敲除小鼠模型构建、细胞分馏和数字PCR（dPCR/ddPCR）检测胞质mtDNA、RNA干扰技术、液相色谱-质谱（LC-MS）分析核苷酸水平、水解末端测序（HydEn-seq）检测mtDNA中核糖核苷酸掺入、碱性凝胶电泳和Southern blot分析、体外复制 assays 使用重组蛋白、纳米字符串（NanoString）技术分析ISG表达谱、免疫组化和免疫荧光分析。样本来源包括：Mgme1^-/-小鼠肾脏、肝脏等组织，原代和永生化MEF细胞，人肺成纤维细胞IMR90，以及衰老模型细胞。

本研究结论表明，核苷酸代谢失衡导致rNTP误掺入mtDNA，引起mtDNA链断裂和片段释放，激活cGAS-STING依赖的炎症反应和SASP。这不仅解释了Mgme1^-/-小鼠年龄依赖性肾炎症的机制，也为线粒体疾病（如RRM2B突变引起的mtDNA耗竭综合征）中的炎症反应提供了分子基础。老年组织中mtDNA rNMP含量增加进一步支持了mtDNA在自然衰老过程中促进炎症反应的作用。这一发现对治疗年龄相关炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症具有深远意义。

该研究由德国马克斯·普朗克衰老生物学研究所、哥德堡大学生物医学研究所、剑桥大学MRC线粒体生物学单元、卡罗林斯卡医学院医学生物化学与生物物理学系、弗莱堡大学医学中心外科病理学研究所、科隆大学CECAD应激反应卓越集群等机构合作完成，发表于《Nature》期刊。