胰腺导管腺癌（PDAC）是全球最具致死性的恶性肿瘤之一，其发病率排名第12位，但癌症相关死亡率高居第6位。目前手术切除仍是唯一可能治愈的治疗方法，然而仅约20%的患者在诊断时符合手术条件。尽管免疫检查点抑制剂等免疫疗法在某些恶性肿瘤中取得了突破性成功，但其在PDAC中的疗效显著受限。这主要归因于PDAC高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME），其特征包括广泛的基质纤维化和免疫抑制细胞浸润，如癌症相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和耗竭的细胞毒性T淋巴细胞。这一免疫屏障不仅促进肿瘤生长和转移，还严重阻碍了免疫疗法的临床成功。
RNA修饰已成为基因表达和肿瘤免疫的关键调节因子。其中，假尿苷（Ψ）是RNA中最丰富的修饰之一，由假尿苷合成酶（PUS）催化尿苷异构化为假尿苷。人类基因组编码13种假尿苷合成酶，分为五个进化上保守的家族：TruA、TruB、TruD、RluA和Pus10p。这些酶广泛参与RNA剪接、稳定性和翻译调控，其失调与多种人类疾病相关。PUS酶对RNA剪接、稳定性和翻译的调控主要通过催化假尿苷（Ψ）形成来实现。PUS家族在癌症和其他人类疾病中的参与日益受到关注。其中，PUS7作为TruD家族的唯一成员，已被证实与胶质母细胞瘤、结直肠癌和胃癌的肿瘤进展相关，根据癌症类型的不同报道了其致癌和抑癌作用。此外，其他PUS家族成员，如PUS1、PUS3、RPUSD3、RPUSD4和PUS10，与线粒体功能障碍、神经发育障碍和自身免疫性疾病相关。这五个家族的PUS酶根据其保守的催化结构域和底物特异性在功能上有所区别。本研究的焦点PUS7，在底物选择上可能与其他家族的成员不同。这些发现表明PUS酶可能参与多种生物过程，并以环境依赖性方式促进疾病发展。
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由DNA、组蛋白、蛋白酶和抗菌蛋白组成的网状结构，由中性粒细胞通过一系列涉及活性氧、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）活性和瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）的过程释放。NETs最初被描述为抗菌防御结构，后来成为肿瘤进展的重要贡献者。研究表明，NETs可以促进上皮-间质转化，增强卵巢癌中的肿瘤生长，并在小鼠模型中加速PDAC进展。除了对肿瘤细胞的直接影响外，NETs还塑造肿瘤免疫微环境。例如，它们可以激活胰腺星状细胞以支持肿瘤增殖，并已被证明在黑色素瘤和胃癌中诱导TAMs的M2极化，从而促进免疫逃避和转移。
本研究进行了PUS家族的全面泛癌分析，整合了转录组、基因组、表观遗传和临床数据集，系统评估了它们在不同癌症类型中的表达模式、预后相关性、通路关联以及与TME的关系。值得注意的是，尽管PUS家族基因在多种恶性肿瘤中表现出异质性表达和临床关联，但PDAC成为一个肿瘤类型，其中PUS相关特征显示出与TME的免疫抑制相关特征特别强的联系。鉴于PDAC的定义特征——包括其致密的基质、深刻的免疫排斥和对免疫检查点阻断的抵抗——这种癌症类型代表了一个生物学相关的背景，其中失调的RNA修饰可能发挥显著的免疫调节作用。
同时，积累的证据表明NETs是PDAC中免疫逃避和疾病进展的关键介质。这些观察使我们假设特定PUS酶的异常活性可能通过调节NET形成和下游免疫细胞极化来促进PDAC的发病机制。因此，选择PDAC作为重点模型来研究PUS7在协调肿瘤微环境内RNA修饰依赖性免疫重塑中的潜在作用。
研究团队首先全面分析了11个PUS家族成员在33种TCGA癌症类型中的表达模式。RPUSD1在泛癌组织中表现出显著升高的表达，其次是TRUB2、TRUB1和PUS3。相比之下，PUS7L和PUS10表达水平较低。比较了18种癌症类型中肿瘤组织与癌旁正常组织中PUS的表达水平。大多数PUS家族成员在泛癌样本的癌旁正常组织中表现出显著升高的表达。此外，还研究了PUS家族成员之间的相关性。共有36个基因对表现出显著的正相关，12个基因对表现出显著的负相关。值得注意的是，PUS7与所有其他家族成员均显示出显著的正相关。
分析了33种癌症类型的总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展生存期（PFS）。值得注意的是，PUS7表达升高在多种癌症类型中 consistently 成为显著的不良预后因素，与较差的临床结果 strongly 相关。CNV分析显示，杂合性扩增和缺失是最普遍的改变，基因表达通常与CNV事件呈正相关。SNV分析显示，PUS7L和PUS7中存在频繁的有害突变，特别是在子宫体子宫内膜癌（UCEC）中。值得注意的是，RPUSD4表达在28种癌症类型中与CNV呈显著正相关，并且mRNA水平在扩增样本中通常升高，在缺失样本中降低。
进一步评估了来自ICGC/TCGA数据集的2683个泛癌样本中的遗传改变。总体而言，26.83%的样本表现出PUS基因改变，其中CNVs（17.97%）的发生率远高于突变（2.09%）。扩增是主要的CNV亚型（15.51%），尤其是在PUS7中。改变频率在不同癌症类型中介于1%至8%之间。急性髓系白血病中观察到突变主导的谱系，而结直肠癌的突变频率最高。扩增在几种癌症中占主导地位，包括肺癌和膀胱癌。Kaplan-Meier分析显示，PUS基因改变与显著较差的总生存期相关（HR = 1.722, p = .0139）。
系统分析了PUS家族基因在33种癌症类型中的甲基化谱，并在14种癌症类型中检测到差异甲基化。与甲基化和基因表达之间已知的负相关关系一致，观察到大多数PUS基因的甲基化与mRNA水平呈负相关，其中PUS7和RPUSD2在TGCT中显示出最强的关联。
研究团队基于ssGSEA算法构建了一个评分系统，用于量化TCGA癌症类型中的PUS家族模式，称为PUSs。在各种癌症类型中，ACC的PUSs最高，而PRAD的PUSs最低。与癌旁正常组织相比，PUSs在肿瘤中显著升高，包括BLCA、BRCA、CESC、COAD、ESCA、KICH、KIRC、KIRP、LUAD、LUSC、PRAD、READ、STAD、THCA和UCEC，而在CHOL和PCPG中降低。对OS、DSS、无病生存期（DFS）和PFS进行了单变量Cox回归分析。较高的PUSs与KIRC和PAAD的风险增加相关，但在LGG的OS中充当保护因素。虽然PUSs在HNSC、KIRC、KIRP、PAAD和THYM中是风险因素，但在LGG、LUSC和STAD的PFS中是保护因素。对于DFS，由于样本量有限，仅在STAD中观察到正相关，其中PUSs充当保护因素。至于DSS，PUSs在KIRC、KIPC、LUAD、PRAD和THYM中是保护性的，但在LGG和STAD中是风险因素。总体而言，PUSs在多种癌症类型中显示出预后预测潜力，在KIRC、LGG和PAAD中具有特别强的预测性能。
考虑到癌症干细胞在肿瘤进展和治疗抵抗中的作用，使用RNA干性评分（RNAss）和DNA干性评分（DNAss）评估了PUSs与肿瘤干性的关系。PUSs在所有癌症中与RNAss呈正相关，在大多数癌症类型中与DNAss呈正相关，表明其在促进干性和肿瘤去分化中的潜在作用。
MSI和TMB是预测ICI反应的既定生物标志物。分析了PUSs与这些生物标志物在不同癌症类型中的相关性。PUSs在18种癌症中与TMB呈正相关，在8种癌症中与MSI呈正相关，其中在STAD中观察到最强的关联。为了研究PUS7家族在癌症中的免疫浸润，分析了PUSs与TME之间的关联。PUSs在大多数癌症中与基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分呈负相关，并且与肿瘤纯度呈正相关。此外，PUSs与大多数免疫检查点基因的表达呈负相关，并且与多种算法中的免疫细胞浸润呈负相关，表明其与免疫抑制性TME相关。
对50个 hallmark 通路进行了GSVA。PUSs与增殖和细胞周期相关通路 strongly 相关，包括E2F靶标、G2M检查点、MYC靶标、有丝分裂纺锤体和DNA修复。此外，PUSs与代谢通路呈正相关，如脂肪酸代谢、糖酵解和氧化磷酸化，表明PUS-high肿瘤中代谢活性升高。
鉴于在KIRC、LGG和PAAD中观察到的PUSs强烈的预后相关性，进一步研究了PUS家族基因在TCGA-PAAD队列中的表达模式和功能意义。PUS1、RPUSD1和RPUSD3的表达水平与RNAss和DNAss呈正相关，但与基质评分和ESTIMATE评分呈负相关。结果表明，PUS家族成员，包括PUS1、RPUSD1、RPUSD3和PUS7，可能有助于增强肿瘤干性和建立PAAD中的免疫抑制微环境。此外，单变量和多变量Cox回归分析证实，PUS7是PAAD患者的独立不良预后因素（HR = 3.824, 95% CI: 1.475–9.916, p = .006）。
为了进一步阐明PUS家族基因表达与肿瘤行为之间的关系，验证了PUS7在PDAC中的mRNA和蛋白水平。TCGA、CPTAC和GSE数据集的整合分析一致显示，PUS7在PDAC组织中显著上调。基于TCGA和GTEx数据集组合的受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.822（95% CI: 0.777–0.867），突出了PUS7在PDAC中的强大诊断潜力。Kaplan-Meier生存分析进一步证明，较高的PUS7表达与PDAC患者较差的总生存期显著相关。
为了在临床标本中验证这些发现，分析了一个包含56名PDAC患者的队列的肿瘤组织。IHC染色证实，与癌旁非肿瘤胰腺组织（ANT）相比，肿瘤组织中的PUS7表达显著更高。值得注意的是，PUS7表达升高与总生存期降低相关，加强了其作为阴性预后标志物的潜力。验证了多个PDAC细胞系中相对于正常胰腺导管上皮细胞（HPDE）的PUS7 mRNA水平和蛋白水平。来自12名PDAC患者的配对肿瘤和癌旁正常组织的Western blot分析进一步证实了肿瘤样本中PUS7蛋白水平的显著增加。总之，这些发现表明PUS7在PDAC中上调并与不良预后 strongly 相关，强调了其作为生物标志物和治疗靶点的潜力。
研究团队建立了稳定过表达或敲低PUS7的PANC-1和MIA PaCa-2细胞系，并通过Western blotting证实了PUS7表达的改变。功能测定，包括伤口愈合、Transwell迁移和侵袭、集落形成和EdU掺入，证明PUS7敲低显著抑制了PDAC细胞的迁移、侵袭、克隆形成和增殖能力。相反，PUS7过表达增强了这些恶性表型。随后在裸鼠中进行了皮下异种移植实验。与对照组相比，PUS7缺失的细胞表现出显著减少的体积和重量，而PUS7过表达的肿瘤显示出明显加速的生长。总之，这些结果表明PUS7沉默在体外和体内抑制肿瘤生长，而其过表达促进肿瘤生长。
为了进一步研究PUS7在PDAC中功能的调控机制，对PUS7过表达的PANC-1细胞进行了 bulk RNA测序。差异表达分析确定了1210个差异表达基因（DEGs），包括723个上调和487个下调基因。GO分析显示，DEGs主要富集在与免疫系统调控、细胞增殖和细胞粘附相关的生物过程中。在分子功能方面，观察到在趋化因子、细胞因子和受体结合活性方面的富集。KEGG通路分析表明，DEGs显著富集于多个免疫和炎症相关通路，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、中性粒细胞胞外诱捕网形成、NOD样受体信号传导和IL-17信号传导。肿瘤细胞的RNA测序分析显示，PUS7过表达显著改变了与中性粒细胞募集和激活相关的多种细胞因子和趋化因子的表达。值得注意的是，几种与NET诱导相关的可溶性因子，包括CXCL2、CXCL8和IL-6，在PUS7过表达的肿瘤细胞中与对照组相比显著上调。进一步的GSEA分析显示，PUS7过表达与各种免疫相关通路呈正相关，包括B细胞受体信号传导、IL-17信号传导、PD-L1和PD-1检查点通路、TH1和TH2细胞分化、Toll样受体信号传导、JAK-STAT信号传导、NF-κB信号传导和NETs形成。
研究团队采用假设驱动的方法来研究PUS7是否通过调节NETs形成促进PDAC进展。为此，建立了胰腺癌的流体动力学小鼠模型。与对照组相比，PUS7过表达显著增加了肿瘤负荷。在整个实验期间，PUS7-OE组的小鼠比对照组更早且更显著地出现体重减轻，这与该组较高的终末肿瘤负荷一致，表明体重变化有效地反映了肿瘤进展的全身影响。此外，PUS7双向调节NETs形成。这通过体内免疫荧光得到证实，显示PUS7过表达肿瘤中关键NETs标志物（MPO和CitH3）的水平上调。在体外，PUS7过表达促进了NETs形成，而其敲低则减少了NETs，通过Sytox Green染色定量并通过Western blot分析证实。总之，这些发现表明PUS7过表达可能促进PDAC中NETs的形成，这可能反过来有助于增强肿瘤进展。
对原位胰腺肿瘤进行了scRNA-seq。总共保留了27,230个高质量细胞用于下游分析。确定了22个不同的细胞簇，使用标记基因表达谱进行细胞类型注释。鉴定了七种主要细胞类型：导管上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、T细胞、内皮细胞和红细胞。通过经典标记物确认了细胞身份：导管上皮细胞的Col3a1和Col1a1；巨噬细胞的C1qc和C1qa；中性粒细胞的S100a8和S100a9；B细胞的Cd79a和Cd79b；T细胞的Cd3e、Cd3d和Cd3g；内皮细胞的Cldn5和Cdh5；和红细胞的Hbb-bt。
PUS7过表达导致导管上皮细胞显著增加，同时免疫细胞群减少，包括巨噬细胞、B细胞和T细胞。CellChat分析显示，在PUS7-OE组中，细胞类型之间的相互作用数量和强度均显著降低，其中中性粒细胞-免疫细胞串扰的下降最为明显。进一步分析显示，来自实质细胞的细胞间信号传导下调，特别是涉及NOTCH、PERIOSTIN、SPP1、CCL、CD45、CXCL和THY1的通路，这些通路介导实质细胞和免疫细胞之间的通信。导管上皮细胞的KEGG通路富集分析显示，PUS7-OE组中免疫激活通路的富集减少，同时葡萄糖和ATP代谢等代谢通路的富集增强。
为了剖析PUS7对巨噬细胞动态的影响，对巨噬细胞群体进行了聚类，并注释了几个功能不同的TAM亚型，包括血管生成性TAMs（Angio-TAMs）、调节性TAMs（Reg-TAMs）、炎症性TAMs（Inflam-TAMs）、增殖性TAMs（Prolif-TAMs）和脂质相关TAMs（LA-TAMs）。PUS7过表达导致抗肿瘤的Inflam-TAMs显著减少，而LA-TAMs、Angio-TAMs和Reg-TAMs显著扩增，表明PUS7影响TAM向免疫抑制表型极化。
为了验证这些发现，将THP-1衍生的M0巨噬细胞与PUS7条件培养基共培养。流式细胞术分析表明，与对照组相比，PUS7过表达显著增加了M2/M1巨噬细胞比率，而PUS7敲低显著降低了M2/M1比率。胰腺组织的免疫荧光染色进一步支持了这一观察，显示PUS7-OE组中CD86巨噬细胞数量减少，CD206巨噬细胞增加。
总之，这些结果表明PUS7过表达通过使其分化偏向免疫抑制表型来损害巨噬细胞的抗肿瘤功能。
为了确定PUS7是否通过NETs促进PDAC进展，通过将稳定过表达PUS7的Pan02细胞（Pan02-PUS7）植入C57BL/6小鼠建立了原位肿瘤模型。用DNase I（一种降解细胞外DNA的酶）处理完全消除了PUS7过表达的促肿瘤作用，表明NETs清除减轻了PUS7驱动的肿瘤生长。体重纵向监测显示，PUS7过表达小鼠表现出更早和更大的体重减轻，而DNase I阻止了这种情况，进一步支持了NETs的全身影响。肿瘤组织的流式细胞术和免疫荧光分析进一步显示，DNase I给药显著减少了PUS7过表达肿瘤中的M2巨噬细胞，同时增加了M1巨噬细胞。此外，来自DNase I处理的PUS7过表达小鼠的肿瘤表现出NETs标志物MPO和CitH3水平降低，证实DNase I在体内抑制了PUS7诱导的NETs形成。
为了直接评估PUS7对NETosis的影响，进行了体外测定。用来自Pan02-PUS7细胞的条件培养基处理中性粒细胞。与体内发现一致，该处理显著增加了经历NETosis的中性粒细胞的百分比，这种效应被添加DNase I所消除。该结果提供了直接证据，表明PUS7过表达以细胞外在方式增强NETosis。然而，NETs是否直接介导PUS7诱导的巨噬细胞极化仍不清楚。
为了严格验证体内效应的特异性，在携带对照肿瘤的小鼠中进行了平行的DNase I处理。与其在PUS7过表达环境中的强效作用相反，DNase I处理在Vector对照肿瘤中没有显著改变肿瘤体积或巨噬细胞极化状态，也没有引起显著的体重减轻。这种直接比较表明，NETs降解的抗肿瘤和免疫调节作用严格依赖于PUS7过表达状态。
为了直接确定NETs是否作为连接PUS7过表达肿瘤细胞与巨噬细胞表型重编程的基本中间体，建立了一个基于Transwell的顺序共培养系统。首先用来自Pan02-PUS7细胞的条件培养基刺激中性粒细胞以诱导NET形成。随后收集产生的含有NETs的上清液并应用于巨噬细胞。为了特异性评估NETs的贡献，在中性粒细胞刺激后添加DNase I（1.5 U/mL）以降解细胞外DNA，而不影响上游中性粒细胞活化。
引人注目的是，暴露于来自PUS7过表达肿瘤细胞的NETs-containing上清液强烈诱导了M2样巨噬细胞极化，这通过显著增加的CD206/CD86比率证明。重要的是，这种效应在DNase I处理后显著逆转，证明NETs的降解有效废除了PUS7驱动的巨噬细胞极化。这些结果提供了直接的机制证据，表明NETs是PUS7诱导的巨噬细胞表型重编程的必要且非冗余的介质。
为了进一步验证体内中性粒细胞和NETs的功能需求，接下来使用抗Ly6G抗体进行了中性粒细胞耗竭实验。有效耗竭中性粒细胞显著减弱了PUS7过表达诱导的加速肿瘤生长。一致地，肿瘤免疫微环境分析显示，中性粒细胞耗竭显著减少了PUS7过表达肿瘤中M2极化巨噬细胞的积累，同时部分恢复了巨噬细胞极化向较少免疫抑制表型的方向。
这些结果表明中性粒细胞是体内PUS7介导的肿瘤生长和巨噬细胞极化所必需的。
比较PUS7过表达（OE）和对照（NC）细胞的RIP-seq分析揭示了一组差异富集的mRNAs。功能富集显示，这些PUS7结合的转录本参与PI3K–Akt、Ras、
