1 引言
癌症免疫治疗领域，基于溶瘤病毒（Oncolytic Viruses, OVs）的生物疗法因其能选择性复制并裂解癌细胞而成为一种颇具前景的策略。溶瘤腺病毒（Oncolytic Adenoviruses, OVs）因其良好的安全性和有效性谱系而被广泛应用。OVs裂解肿瘤细胞后能大量释放肿瘤相关抗原，随后招募树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）等免疫细胞浸润肿瘤部位，实现抗原捕获、处理并呈递给T细胞，从而引发肿瘤特异性T细胞免疫。然而，临床结果显示OVs的疗效未达预期。在先前研究中观察到，OVs在裂解肿瘤细胞的同时，也会裂解招募来的DCs，从而影响了肿瘤特异性T细胞免疫的功效。此外，瘤内注射OVs（主要的临床给药途径）受到实体瘤内高压和物理屏障的限制，影响了OVs的分布和治疗效果。因此，开发能够克服这些局限的溶瘤病毒疗法对于增强癌症免疫治疗至关重要。
肿瘤细胞源性细胞外纳米囊泡（Tumor cell-Derived Extracellular Nanovesicles, TDEVs）是细胞分泌的尺寸约40-150纳米的纳米级球形脂质双层囊泡，具有显著的同源细胞摄取能力。已知TDEVs表面表达的CD47具有同源靶向能力，并发出“别吃我”（Don't eat me）信号以逃避免疫细胞的识别和清除。值得注意的是，维持TDEVs的完整性和稳定性对其功能发挥至关重要。在现有研究中，TDEVs主要通过重复物理挤压或电穿孔进行包封作为药物载体，但这些繁琐的方法可能会损害TDEVs的蛋白质完整性，影响其生物学功能。
为此，研究团队开发了一种基于微针（Microneedle, MN）的原位TDEVs包被OVs（TDEVs@OVs）平台。该技术将预感染OVs的肿瘤细胞加载到MN装置的上层储库中，MN中间的聚碳酸酯膜可阻止肿瘤细胞通过，同时允许TDEVs@OVs持续释放。此外，上层的乳胶弹性膜可提供持续的收缩力以促进TDEVs@OVs通过中空MN扩散。释放的TDEVs@OVs能够归巢至同源癌细胞，同时减少DCs的非期望摄取。这种对癌细胞的高度选择性细胞毒性以及有效防止DCs耗竭的能力，将增强DCs介导的T细胞免疫，并最大化OVs的免疫刺激潜力。此外，MN阵列可以促进药物在肿瘤内的均匀分布，以克服肿瘤固有的物理屏障，从而增强OVs的抗肿瘤功效。
2 结果
2.1 制备与表征
本研究开发了基于MN的原位TDEVs包被OVs平台。将预感染OVs的小鼠肺癌细胞（TC-1）加载到中空MN中，TC-1外泌的TDEVs@OVs从MN装置中释放用于癌症免疫治疗。MN阵列由固定在有孔的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）底座上的不锈钢中空微针组成。代表性MN贴片呈3×3阵列排列，每个针高度约1450微米，基底直径310微米，内径160微米。约3微米孔径的聚碳酸酯膜的微孔结构通过扫描电子显微镜验证。OVs储库由乳胶弹性膜封闭以增强细胞储存能力，且该膜表现出优异的变形能力，便于TDEVs@OVs溶液的运输。
动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）用于表征OVs、TDEVs和TDEVs@OVs。裸露OVs和TDEVs的直径分别为98.15 ± 1.13纳米和83.88 ± 5.08纳米，而TDEVs@OVs的直径为114.97 ± 2.45纳米。相比之下，TC-1细胞直径超过10微米，这进一步支持了TDEVs@OVs可成功穿过聚碳酸酯膜，而TC-1细胞被有效隔离在中空MN上层储库中的前提。蛋白质印迹结果显示，与纯化的TDEVs相似，在TDEVs@OVs中也检测到了生物标志物TSG101、CD9、CD81以及“别吃我”信号生物标志物CD47。为了进一步证明OVs被TDEVs包被，使用Cy5标记的CD9（TDEVs常见生物标志物）抗体标记TDEVs@OVs。免疫荧光染色显示，在TDEVs@OVs中观察到红色CD9荧光与绿色OVs荧光的共定位。使用另一种生物标志物CD81也观察到TDEVs与OVs的共定位，表明包被在OVs上的膜是TDEVs。为了进一步确认OVs与TDEVs的结构关联，使用腺病毒特异性抗六邻体抗体进行了免疫沉淀测定。结果显示，高比例的裸露OVs被有效沉淀，而TDEVs@OVs组的沉淀效率显著降低，表明病毒衣壳被TDEVs屏蔽。值得注意的是，用Triton X-100破坏TDEV脂质双层后，抗六邻体抗体对TDEVs@OVs的沉淀效率显著增加，为OVs包裹在TDEVs内提供了强有力的生化证据。使用抗CD9和CD81抗体的流式细胞术分析进一步证明了OVs与TDEV标志物之间的强关联性，表明大部分OVs呈CD9和CD81阳性，为OVs在TDEVs内成功包封提供了额外证据。
此外，通过CCK-8法评估了OVs预感染TC-1细胞的活力，表明低病毒剂量OVs预感染的TC-1细胞在48小时后未表现出显著细胞死亡。将OVs预感染的TC-1细胞加载到MN中，并在室温下孵育后通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估其活/死活力。结果表明，OVs预感染的TC-1细胞可在MN内存活48小时。而且，通过聚合酶链式反应（PCR）检测到从MN释放的OVs。当MN加载裸露OVs或剂量相当于108pfu OVs的OVs预感染TC-1细胞时，两者释放的OVs量在约48小时时几乎相同。
2.2 MN基原位TDEVs包被OVs的体外评价
为了评估OVs对DCs的细胞毒性，首先将DC2.4细胞系与不同浓度的OVs共孵育。OVs对DCs显示出显著的细胞毒性。一致地，将从C57BL/6小鼠收集的骨髓源性树突状细胞（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells, BMDCs）与不同浓度的OVs共孵育，进一步探究OVs对BMDCs的细胞毒性能力。OVs对BMDCs也显示出显著的细胞毒性。然而，在骨髓源性巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDMs）和脾源性CD3+T细胞中，相同浓度的OVs观察到的细胞毒性很弱。此外，通过共孵育分泌的TDEVs@OVs或裸露OVs，评估了对BMDCs和TC-1细胞的细胞毒性能力。与OVs组相比，TDEVs@OVs处理组对BMDCs的细胞毒性降低，表明TDEVs@OVs保护了DCs免受OVs诱导的细胞死亡。相反，与OVs组相比，TDEVs@OVs处理组对TC-1细胞显示出强大的细胞毒性能力，这表明从MN释放的TDEVs@OVs具有选择性细胞毒性能力。同时，采用抗CD47抗体阻断实验评估了TDEVs@OVs与裸露OVs对BMDCs和TC-1细胞的细胞毒性效应。CD47阻断显著增强了TDEVs@OVs对BMDCs的细胞毒性。相比之下，TDEVs@OVs对TC-1细胞的强细胞毒性效应未明显改变，且仍显著高于裸露OVs组。这些结果证实，TDEVs@OVs可通过“别吃我”信号机制保护DCs免受OVs诱导的细胞死亡。
进一步研究了从MN释放的TDEVs@OVs的细胞摄取机制。结果表明，与裸露OVs组相比，TDEVs@OVs在BMDCs中的摄取显著减少。相反，TDEVs@OVs在TC-1细胞中的摄取显著增加。此外，进行了抗CD47抗体阻断实验以进一步验证。抗CD47处理显著增加了BMDCs对TDEVs@OVs的摄取。相比之下，TC-1细胞对TDEVs@OVs的摄取未受明显影响，且仍显著高于裸露OVs。这些发现与细胞毒性测定结果一致。此外，为了证明TDEVs@OVs在多细胞系统中的选择性摄取能力，在体外建立了BMDCs-TC-1细胞共培养模型，通过流式细胞术评估OVs在BMDCs（CD45+CD11c+）和TC-1细胞（CD45−CD11c−）中的摄取效率。流式细胞术分析结果显示，在裸露OVs处理组中，约64%摄取的OVs分布在BMDCs中，36%在TC-1细胞中；而在TDEVs@OVs处理组中，约20.2%的OVs被BMDCs摄取，79.8%被TC-1细胞摄取。结果进一步证实，TDEVs@OVs可增强TC-1细胞的摄取能力，同时逃避免BMDCs的摄取。
进一步在体外TC-1-BMDCs-CD3+T细胞共培养模型中评估了TDEVs@OVs促进DCs成熟和免疫激活的能力。将BMDCs与TC-1细胞共培养，并用从MN收集的裸露OVs或TDEVs@OVs处理。孵育24小时后，引入CD3+T细胞并再共培养48小时。随后，收集共培养模型中的细胞进行流式细胞术分析。结果显示，与裸露OVs相比，TDEVs@OVs在促进DCs（CD11c+CD80+CD86+）成熟方面表现出更大功效。此外，TDEVs@OVs处理组可激活CD8+T细胞，从而诱导肿瘤特异性T细胞免疫。而且，观察到TDEVs@OVs可防止DCs耗竭，证据是BMDCs在BMDCs-TC-1细胞共培养模型中 prolonged 和持续分泌促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）。
此外，为了探索MN阵列与单针注射OVs相比TDEVs@OVs的均匀分布，开发了含有肿瘤细胞的体外3D Matrigel模型模拟实体瘤。CLSM图像显示，MN通过其阵列结构促进了OVs更广泛的分布，而基于单针的注射组则局限于 confined 空间。然后，在TC-1-hCD46异种移植瘤荷瘤小鼠中比较了瘤内注射和MN介导递送后OVs的瘤内分布。CLSM图像显示，通过瘤内注射，OVs局限于注射区域。相比之下，MN处理组显示出显著的肿瘤浸润。
2.3 体内抗肿瘤功效与免疫激活能力
在携带TC-1-hCD46肿瘤的C57BL/6小鼠异种移植瘤模型中探索了MNs (TDEVs@OVs)的溶瘤潜力。将荷瘤小鼠分为五组，分别通过瘤内注射接受特定治疗：PBS、MNs (TC-1)、MNs (OVs)、OVs和MNs (TDEVs@OVs)。MNs (TC-1)治疗未表现出显著的肿瘤生长抑制。用MNs (OVs)和OVs治疗的动物表现出中度的肿瘤生长抑制，而在MNs (TDEVs@OVs)治疗组中观察到TC-1肿瘤生长的显著减少和生存期的延长。荷瘤小鼠的体重或主要器官的组织病理学检查未观察到显著改变。肝肾功能指标，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酐和血尿素氮，未表现出显著变化。此外，评估了MNs (TDEVs@OVs)的长期安全性谱。C57BL/6小鼠在给药30天后未表现出显著的器官损伤或肝肾功能指标异常变化，证明了MNs (TDEVs@OVs)良好的安全性。此外，还测定了所有组别肿瘤中各种细胞因子的水平。对IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-12P70、TNF-α、IL-23和IL-27的定量表明，MNs (TDEVs@OVs)治疗组中所有测试的细胞因子水平均升高。由于部分细胞因子主要由DCs分泌，如IL-6、IL-12P70、TNF-α、IL-23和IL-27，这进一步证实了基于MN的原位TDEVs包被OVs治疗后有效防止了DCs耗竭并促进了适应性免疫应答。
DCs在连接肿瘤抗原与T细胞应答中起关键作用。成熟DCs表达高水平的共刺激分子如CD80和CD86，可促进T细胞增殖、分化和存活。本文采用免疫荧光法在TC-1-hCD46荷瘤C57BL/6小鼠模型中探索MN的免疫刺激潜力。用荧光标记抗体标记肿瘤样本以评估CD11c+DC细胞和CD8+T细胞的浸润。与对照组相比，在用MNs (TDEVs@OVs)治疗的肿瘤中观察到CD11c+DC细胞和CD8+T细胞的显著流入。此外，通过流式细胞术在第三次治疗后分析肿瘤内的成熟DCs（CD45+CD11c+CD80+CD86+），显示MNs (TDEVs@OVs)治疗组比例更高，表明用于激活肿瘤特异性T细胞的DCs募集和成熟增强。此外，肿瘤和脾脏中细胞毒性T淋巴细胞（CD45+CD3+CD8+）的流式细胞术分析显示，MNs (TDEVs@OVs)组中CD8+T细胞增多，导致抗肿瘤应答增强。在MNs (TDEVs@OVs)治疗组内观察到调节性T细胞（CD45+CD3+CD4+FOXP3+）的显著减少，表明免疫抑制条件的重塑。进一步分析涉及收集和检查血液中的记忆T细胞（CD45+CD3+CD8+CD62L−CD44+）以评估MNs (TDEVs@OVs)触发的抗肿瘤免疫记忆效应。结果显示MNs (TDEVs@OVs)组中记忆T细胞增多，展示了MNs (TDEVs@OVs)作为诱导持续长期免疫应答的有效方法所具备的强大免疫记忆保护。
2.4 体内肿瘤复发与转移抑制
基于上述免疫细胞介导的抗肿瘤免疫应答，进一步研究了MNs (TDEVs@OVs)对术后残留肿瘤的治疗效果。将携带TC-1-hCD46异种移植瘤的雌性C57BL/6小鼠分为五组。原发肿瘤体积达到400 mm3后，切除肿瘤，留下5%的残留肿瘤块以评估术后原发残留肿瘤的复发情况，通过活体成像系统（IVIS）成像和游标卡尺监测。虽然用MNs(OVs)和OVs治疗的动物能适度抑制肿瘤复发，但MNs (TDEVs@OVs)治疗组在抑制肿瘤复发方面显示出最佳能力。该组五只小鼠中有三只显示检测不到的肿瘤，而另外两只显示弱肿瘤复发。此外，在治疗16天后接种 distant 肿瘤以模拟肿瘤转移。结果显示，用MNs (TDEVs@OVs)治疗的组表现出最强的抗转移功效。此外，在29天的过程中未观察到体重的显著波动。总之，MNs (TDEVs@OVs)的应用表现出高治疗有效性和良好的生物安全性谱。
3 讨论
本研究描述了一个基于MN的原位分泌TDEVs包被OVs的平台。将预感染OVs的TC-1细胞加载到中空MN上层储库的策略可以阻止肿瘤细胞通过，同时促进TDEVs@OVs的持续释放。释放的TDEVs@OVs表现出特异性靶向肿瘤部位癌细胞的能力。更重要的是，它们还能够通过“别吃我”信号机制减少DCs的摄取。肿瘤微环境内对肿瘤细胞的选择性细胞毒性有效防止DCs耗竭，以增强DC介导的T细胞免疫并最大化OVs的免疫刺激潜力。此外，MN阵列破坏了固有的物理屏障，促进了药物在肿瘤区域内的均匀分布，进一步增强了MNs (TDEVs@OVs)的抗肿瘤功效。
尽管结果令人鼓舞，但关于安全性、普适性和临床转化的几个方面值得进一步讨论。首先，将活肿瘤细胞纳入医疗器械引发了合理的安全担忧，包括活肿瘤细胞潜在泄漏和继发性肿瘤形成的理论风险。尽管当前设计包含了一个能有效保留细胞同时允许纳米囊泡通过的聚碳酸酯膜，但在临床应用前，严格的长期安全性评估（包括在生理条件下测试装置完整性以及在免疫健全和免疫缺陷模型中进行致瘤性研究）将是必不可少的。未来的迭代也可以探索使用辐照或复制无能肿瘤细胞以进一步减轻任何残留风险。
其次，虽然我们的平台在TC-1-hCD46异种移植模型中显示出显著疗效，但其在其他肿瘤类型和动物物种中的普适性仍有待确定。不同的癌症表现出表面标志物的异质性表达，这可能影响OV趋向性和TDEV归巢。采用一组癌细胞系和患者来源异种移植物的进一步研究，以及在更大动物模型（如兔或猪）中的测试，将有助于评估该方法的更广泛适用性。此外，该平台通过不同细胞外囊泡递送其他治疗 cargo（如细胞因子、siRNA或化疗药物）的多功能性值得探索。
第三，关于临床转化，我们的系统必须在良好对照的比较研究（如瘤内OV注射）中与现有标准疗法进行评估。尽管我们的MN平台在持续释放和改善分布方面具有优势，但可扩展性、制造重现性和无菌保证 presents 显著挑战。为TDEVs@OVs生产建立稳健的质量控制标准至关重要。此外，患者特异性因素如肿瘤可及性、皮肤厚度和免疫状态可能影响治疗结果，需要在临床试验设计中仔细考虑。
总之，基于MN的原位TDEV包被OV平台代表了一种通过最小化脱靶免疫细胞毒性和促进适应性抗肿瘤免疫来增强溶瘤病毒治疗的新策略。虽然当前的概念验证数据令人鼓舞，但未来的工作应侧重于解决上述安全性、普适性和可制造性挑战。随着持续优化和验证，这种方法在增强癌症免疫治疗方面具有相当大的前景。
4 材料与方法
（此部分为实验细节，主要包含材料来源、MN制备与表征、TDEVs分离、TDEVs@OVs表征、蛋白质印迹分析、BMDCs/BMDMs/CD3+T细胞分离、免疫沉淀测定、细胞活力测定、体外细胞摄取、体外共培养系统免疫激活能力评估、体内抗肿瘤效果评估、流式细胞术分析、抑制肿瘤复发和转移效果评估以及统计分析等方法描述。具体实验步骤和参数如前文所述，此处不再赘述。）
