引言
肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophages, AMs）和肺泡上皮细胞是抵御吸入性病原体的第一道防线。它们之间的相互作用强烈影响着肺部的固有免疫应答，然而这种细胞间通讯的具体机制尚未被完全阐明。肺泡巨噬细胞是一类独特的组织驻留巨噬细胞，其分化、存活和功能维持依赖于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF），而非巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage Colony-Stimulating Factor, M-CSF）。与由骨髓单核细胞补充的巨噬细胞不同，肺泡巨噬细胞起源于胎肝单核细胞，并在肺内自我更新。肺泡上皮细胞，特别是II型肺泡上皮细胞，通过分泌表面活性物质等因子，塑造了肺泡腔独特的免疫微环境，并对肺泡巨噬细胞的分化和功能具有重要影响。细胞间粘附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1, ICAM-1）作为一种跨膜糖蛋白，已被证实是介导巨噬细胞与上皮细胞相互作用的关键分子，尤其在LPS刺激的免疫应答中。
材料与方法
本研究采用MPI肺泡巨噬细胞样细胞（一种原代、非转化、持续增殖且GM-CSF依赖的巨噬细胞模型，能准确模拟肺泡巨噬细胞的特性）与MLE-12小鼠肺泡II型上皮细胞系建立共培养体系。MPI细胞在含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）和10 ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培养基中培养。MLE-12细胞在含有2% FBS及多种添加物（胰岛素-转铁蛋白-硒、氢化可的松、β-雌二醇）的DMEM/F12培养基中培养。共培养时，先将MLE-12细胞接种形成单层，再加入MPI细胞。使用来自大肠杆菌O111:B4的100 ng/mL超纯LPS刺激细胞。通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、Luminex多因子检测、流式细胞术（包括磷酸化流式细胞术检测MAPK通路和NF-κB活化）、荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）以及细胞内细胞因子染色和荧光显微镜等技术分析细胞因子分泌、表面分子表达、信号通路活化和细胞凋亡等情况。实验中使用ICAM-1和TNF-α的中和抗体来探究其功能。数据统计分析使用GraphPad Prism软件。
结果
LPS诱导的细胞因子反应在MPI/MLE-12共培养中增强
在无血清条件下，与MPI或MLE-12细胞单独培养相比，LPS刺激的共培养体系表现出多种促炎细胞因子和趋化因子（包括IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-2、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IL-1α）分泌的显著增强。单独培养的MPI细胞对LPS的反应较弱。共培养体系中IL-6的产生呈LPS剂量和时间依赖性，并且与共培养中MPI细胞的数量相关。
MLE-12细胞产生LBP
研究发现，MLE-12细胞是脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide Binding Protein, LBP）的来源，其在共培养条件下也能分泌LBP。LBP对于MPI细胞通过TLR4识别LPS至关重要，这解释了在无血清条件下共培养体系对LPS产生强反应的原因。
非LBP依赖的机制也促进共培养细胞因子反应增强
除了LPS，共培养体系对TLR2/6激动剂FSL-1和蟑螂提取物（另一种TLR2刺激物）的细胞因子反应也显著增强，这表明除了上皮细胞来源的LBP外，还存在LBP非依赖的机制共同放大了免疫应答。
直接细胞接触是共培养协同效应所必需的
即使在含有血清（即外源性LBP）的条件下，共培养仍能增强LPS反应，但增强幅度小于无血清条件。短期（3小时）共培养不足以增强反应。使用未刺激或LPS刺激的MLE-12细胞条件培养基培养MPI细胞，均无法重现共培养的协同增强效应，表明直接细胞间接触是必需的，可溶性因子 alone 不足以介导此效应。
LPS刺激的共培养中MLE-12细胞ICAM-1表达上调
流式细胞术分析显示，在共培养并经LPS刺激后，MLE-12细胞表面的ICAM-1表达显著增加，而单独培养的MLE-12细胞即使经LPS刺激，ICAM-1表达也无明显变化。MPI细胞本身具有较高的基础ICAM-1表达，LPS刺激后其表达进一步增加。
MPI细胞分泌的可溶性因子诱导MLE-12细胞ICAM-1表达及凋亡
使用经LPS刺激并去除LPS的MPI细胞条件培养基（活化MPI培养基）培养MLE-12细胞，可诱导其ICAM-1表达上调并引发细胞凋亡（表现为细胞皱缩、膜起泡和Caspase-3/7活性增加）。而未刺激的MPI细胞条件培养基无此效应。
TNF-α是MPI细胞诱导MLE-12细胞ICAM-1表达和凋亡的关键因子
重组TNF-α能以剂量依赖的方式诱导MLE-12细胞ICAM-1表达和凋亡。在LPS活化的MPI条件培养基中加入TNF-α阻断性抗体，则能抑制其对MLE-12细胞ICAM-1表达的上调和凋亡的诱导作用，证实TNF-α的核心作用。
共培养中LPS刺激导致MPI细胞MAPK和MLE-12细胞NF-κB活化增强
磷酸化流式细胞术分析显示，在LPS刺激的共培养中，MPI细胞的MAPK信号通路（ERK、p38、JNK）活化增强（ERK活化提前，p38和JNK活化延迟），而MLE-12细胞的NF-κB活化则从早期（1-4小时）即显著增强。
活化的MLE-12细胞可诱导初始MPI细胞产生趋化因子
将MLE-12细胞先用LPS活化的MPI条件培养基处理（制备成炎症性MLE-12细胞，MLE-12inflam），再与初始MPI细胞共培养，即使不额外添加LPS，也能诱导MCP-1、MIP-2和IP-10的分泌显著增加，但不诱导IL-6和TNF-α。使用ICAM-1阻断抗体预处理MLE-12inflam细胞，可特异性抑制MCP-1的产生，而对MIP-2和IP-10无影响，表明MCP-1的产生依赖于ICAM-1。
MLE-12细胞是LPS刺激共培养中MCP-1的主要细胞来源
通过细胞内染色和荧光显微镜观察发现，在LPS刺激的共培养中，MLE-12细胞是MCP-1更主要的产生细胞，其产生的MCP-1水平高于共培养中的MPI细胞。
讨论
本研究阐明了肺泡上皮细胞与肺泡巨噬细胞样细胞之间相互作用协同放大细菌内毒素（LPS）固有免疫应答的多种机制。上皮细胞来源的LBP为TLR4有效识别LPS提供了关键条件。此外，LBP非依赖的机制，特别是直接细胞接触，也发挥着重要作用。研究揭示了一个由TNF-α–ICAM-1–MCP-1构成的信号轴：LPS激活的MPI细胞释放TNF-α，TNF-α诱导MLE-12细胞表达ICAM-1并引发凋亡；上调的ICAM-1通过细胞接触依赖的方式，进而促进MLE-12细胞产生MCP-1。信号通路分析显示共培养特异性地增强了MPI细胞的MAPK活化和MLE-12细胞的NF-κB活化。这些发现揭示了肺泡免疫界面处一个精密的协同与放大网络，涉及可溶性因子、直接细胞接触和表面分子（如ICAM-1）的多重互动。该研究建立的MPI–MLE-12共培养模型为剖析肺部固有免疫机制提供了一个可操作的研究平台，其发现对于理解肺炎、急性肺损伤等肺部炎症性疾病的发病机制具有启示意义。研究的局限性在于使用了细胞系模型和较强的TLR配体刺激，未来需要互补的体内外模型加以验证和拓展。
