番茄果实发育与成熟过程中的血清素代谢调控机制
在植物发育生物学研究领域，番茄（Solanum lycopersicum）作为模式作物为果实成熟机制研究提供了重要平台。近年研究发现，血清素（serotonin）作为一种色氨酸衍生的吲哚胺类物质，在番茄果实发育过程中积累，可能同时参与植物防御机制和人类营养调节。然而，这种神经活性代谢物在果实成熟过程中的调控机制仍不清楚。本研究通过多学科交叉方法，揭示了MADS-box转录因子FUL2与MADS1形成调控模块，通过直接靶向血清素生物合成通路关键基因，精细调控血清素稳态的新机制。
FUL2基因功能缺失突变体的表征分析
为阐明FUL2的生物学功能，研究团队利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了ful2基因功能缺失突变体（ful2-cr1和ful2-cr2）。在破色期后5天（Br+5），突变体果实呈现独特的橙色色素沉着，与野生型（WT）果实的均匀红色形成鲜明对比。虽然ful2-cr1和ful2-cr2突变体果实在成熟后期仍能实现全红着色，但始终表现出果型减小和表面条纹不规则等典型FUL2缺陷表型。
通过广靶代谢组学分析发现，ful2-cr1突变体及含有FUL2突变的组合突变体（rin ful2-cr1和rin ful1 ful2-cr1）中血清素积累显著增加。值得注意的是，rin-cr1、ful1-cr1和rin ful1-cr1品系中的血清素水平与野生型相比无变化，表明FUL2对血清素代谢通路具有独特的调控作用。靶向定量分析证实，ful2-cr1和ful2-cr2突变体果实中的血清素水平显著高于野生型，血清素含量升高约10倍，这一发现揭示了FUL2作为果实发育和成熟过程中血清素生物合成转录抑制因子的新功能。
FUL2互作蛋白MADS1的功能鉴定
为识别FUL2在果实发育和血清素代谢中的潜在调控伙伴，研究人员构建了CBC启动子驱动FUL2蛋白表达的转基因番茄株系。免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）分析鉴定出多个FUL2相关蛋白，包括已知的成熟相关转录因子（RIN、FUL1、TAGL1和MADS1）。通过创建各个候选基因的CRISPR/Cas9敲除突变体进行功能表征，发现在Br+10阶段，mads1-cr1突变体果实在果型减小方面最接近ful2-cr1突变体表型。
扩展表型分析显示，mads1-cr1和mads1-cr2均重现了ful2-cr1突变体的关键特征，特别是成熟进程延迟和最终果型显著减小。然而，花序结构表型在ful2-cr和mads1-cr突变体间存在明显差异：ful2-cr突变体花序发育正常，而mads1-cr1和mads1-cr2突变体每个花序的分枝数显著增加。转录组测序分析发现，ful2和mads1突变体与野生型相比的差异表达基因（DEGs）存在显著重叠，约58%的MADS1依赖性转录本包含在这一共享的DEGs库中，表明MADS1的调控能力可能需要FUL2活性，两者可能在一个共同的控制果实发育和成熟的信号网络中运作。
FUL2与MADS1的物理相互作用验证
基因组定位分析显示，FUL2和MADS1位于3号染色体的相邻位点，并在果实成熟过程中表现出协调的表达模式，随着成熟进程均呈现表达下调。通过酵母双杂交（Y2H）实验证实了FUL2和MADS1之间的直接相互作用。该相互作用在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中通过分裂荧光素酶互补（split-LUC）实验独立验证，共表达的FUL2和MADS1融合蛋白产生强烈的发光信号。双分子荧光互补（BiFC）实验在本氏烟表皮细胞中证明了FUL2和MADS1的核定位相互作用。利用标签蛋白进行的天然共免疫沉淀（Co-IP）实验进一步证实了FUL2和MADS1的物理相互作用。这些结果通过多个独立实验确立了FUL2和MADS1作为直接相互作用伙伴。
FUL2-MADS1模块对血清素生物合成通路的转录调控
为阐明FUL2和MADS1控制血清素积累的转录网络，研究人员分析了色氨酸向血清素及其衍生物褪黑素转化通路中相关基因在突变体与野生型中的表达水平。转录组分析显示，在FUL2和MADS1突变体中，血清素通路基因表达显著失调。最显著的是，编码色氨酸脱羧形成色胺的酶TDC1的表达在FUL2和MADS1突变体中强烈上调；而负责血清素向褪黑素最终转化的ASMT5表达在突变体中显著降低，表明代谢流向受损导致血清素积累。这些代谢和转录数据支持一个模型，即FUL2和MADS1作为血清素生物合成的主要转录调控因子，协调控制通路基因表达以维持番茄果实发育和成熟过程中的血清素稳态。
FUL2全基因组靶基因识别与结合特性
染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析揭示了FUL2结合位点显著富集CArG-box基序，这是MADS-box转录因子的典型DNA识别序列。FUL2 ChIP-seq峰分布分析显示优先定位于启动子区域（48%位于转录起始点上游2kb内），与其转录调控功能一致。将FUL2结合的启动子与mads1-cr1和ful2-cr转录组的差异表达基因（DEGs）进行功能整合，识别出746个共同靶标，包括ASMT5。基因组浏览器可视化确认了FUL2在ASMT5启动子区域的显著占据，直接将这一结合事件与ful2-cr突变体中观察到的ASMT5下调联系起来，确立了FUL2在控制血清素向褪黑素转化中的作用。
血清素通路基因的定量RT-PCR验证证实了FUL2的调控作用，显示在ful2-cr和mads1-cr突变体中TDC1显著上调和ASMT5下调，与转录组谱一致。这些结果证明了FUL2介导的对血清素生物合成中限速酶的转录控制。综合数据支持一个机制模型，即启动子结合的FUL2通过调控关键通路基因，特别是通过抑制ASMT5，来协调代谢流，促进成熟过程中的血清素积累。
FUL2-MADS1复合物对ASMT5的直接转录激活
电泳迁移率变动分析（EMSA）使用来自ASMT5启动子的Cy5标记CArG-box探针显示，FUL2和MADS1表现出协同DNA结合。虽然单独使用任一种蛋白均未形成稳定复合物，但它们的组合产生了明显的条带偏移。竞争实验证实了序列特异性，因为结合被野生型而非突变的CArG-box寡核苷酸消除。在本氏烟的双荧光素酶报告中，共表达的FUL2和MADS1对ASMT5启动子-LUC报告基因的协同激活证明了功能协同性。这些结果确定FUL2-MADS1异源二聚体通过CArG-box结合直接调控ASMT5表达，为果实发育和成熟过程中的血清素通路控制提供了分子机制。
讨论与展望
FUL2（先前命名为MBP7）属于番茄中FRUITFULL（FUL）转录因子亚家族。先前研究表明，FUL2及其旁系同源物FUL1可能独立地以及与MADS-RIN协同调控番茄果实成熟。虽然单个ful1和ful2 CRISPR/Cas9突变体表现出正常的红色成熟表型，但ful1 ful2双突变体显示严重的成熟障碍，揭示了这些旁系同源物之间的遗传冗余。另一方面，FUL2功能缺失导致果型减小，而FUL1突变体保持野生型果型，揭示了这些旁系同源物在调控果实发育方面的独特功能作用。ful1和ful2突变体的详细转录组和代谢组分析显示，细胞壁修饰酶表达谱的协调变化以及与挥发性有机化合物生物合成相关基因的显著改变，表明这两个基因可能作为果实营养代谢的调控因子。
关键成熟调控突变体的代谢组学分析揭示了血清素积累的独特模式。虽然ful2-cr单突变体、rin ful2-cr双突变体和rin ful1 ful2-cr三突变体与野生型相比均表现出显著升高的果实血清素含量，但rin-cr或ful1-cr单突变体未显示此类变化。这些发现表明FUL2具有调控血清素代谢的内在能力，这种能力独立于与MADS-RIN和FUL1的功能相互作用。蛋白质免疫沉淀结合质谱（IP-MS）分析鉴定出MADS1作为FUL2的直接相互作用伙伴，揭示了番茄果实发育网络中一个先前未表征的调控节点。
MADS1（也称为EJ2）代表另一个在番茄发育中具有多效性功能的MADS-box转录因子。先前研究表明，MADS1作为果实成熟的负调控因子，并在尊片发育过程中高表达。此外，MADS1与MACROCALYX（MC）物理相互作用以调控尊片生长和特性，并通过调控分生组织活性影响花序结构。尽管这些在发育中的作用已确立，但MADS1在初级或特化代谢调控中的潜在参与，特别是在果实成熟过程中，仍然 largely unknown。我们的分析进一步证实了MADS1在花序结构调控中的关键作用。mads1-cr突变体每个花序的分枝数显著增加，每个花序的果实数增多且果型减小。相比之下，ful2-cr突变体影响果型但不增加每个花序的分枝数，表明FUL2和MADS1在果实发育过程中功能保守。先前研究的遗传证据表明，FUL2和MBP20双突变体表现出增强的花序分枝，支持FUL2和MBP20在花序形态发生调控中潜在的功能冗余。
FUL2和MADS1是基因组相邻的基因，具有相似的表达模式。它们在花发育、果型决定和成熟控制中的协调作用可能反映了共同上游因子的共同调控以及发育通路中的功能汇聚。虽然先前研究已确立FUL2作为成熟调控因子，但我们的发现通过揭示其在通过ASMT5抑制血清素生物合成中的直接作用进一步扩展了其功能范围。这突出了超越经典成熟控制的新调控层，并表明FUL2将发育信号与次级代谢通路整合。
我们的研究阐明了FUL2和MADS1在协调果实发育和成熟过程中的血清素代谢。在番茄中，血清素生物合成通过两步酶促通路发生：色氨酸脱羧酶（TDC）最初将色氨酸转化为色胺，随后被色胺5-羟化酶（T5H）羟基化产生血清素。这种血清素作为调控分子影响多种植物激素介导的生长过程。此外，血清素作为褪黑素的前体，由血清素N-乙酰转移酶（SNAT）、COMT和ASMT催化其转化。作为一种多效性信号分子，褪黑素在植物胁迫响应中发挥关键作用，包括耐热性和抵御多种非生物和生物挑战。发现FUL2-MADS1异源二聚体同时激活ASMT5为成熟过程中观察到的血清素和褪黑素水平之间的反比关系提供了机制解释。这种双重调控能力揭示了核心发育因子可以直接调控代谢通路。
FUL2、MADS-RIN和FUL1共同结合CArG-box基序以调控下游靶基因表达，同时展现出对参与果实发育和营养代谢的特定靶基因的 distinct regulatory specificities。这种多方面的控制系统可能整合了额外的调控组件，包括表观遗传因子。例如，DNA甲基化作为一种表观遗传机制，通过该机制MADS-RIN通过转录激活GAME基因调控甾体糖碱代谢。mads1和ful2突变体果实的比较转录组分析显示差异表达基因（DEGs）存在显著重叠，58%的MADS1相关DEGs在ful2突变体中共同出现，表明果实发育中的功能互依性。电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步揭示，虽然MADS1或FUL2单独在体外不结合CArG-box基序，但它们的异源复合物表现出特异性DNA结合活性。这些发现确立了FUL2-MADS1模块作为果实发育程序和血清素代谢通路的关键调控因子。
材料与方法概要
本研究使用野生型番茄（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig）进行所有实验。通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑生成敲除突变体（ful2-cr1、ful2-cr2、rin-cr1、ful1-cr1、tagl1-cr1、mads1-cr1和mads1-cr2）。酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、分裂荧光素酶互补（Split-LUC）和共免疫沉淀（Co-IP）实验用于验证蛋白质相互作用。免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）鉴定FUL2互作蛋白。电泳迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶报告基因检测用于研究DNA结合和转录激活。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）用于全基因组识别FUL2结合位点。通过RNA测序进行转录组分析，使用DESeq2进行差异基因表达分析。通过UPLC-ESI-MS/MS进行血清素的绝对定量。
研究意义与应用前景
该研究建立了FUL2-MADS1模块作为协调果实发育程序与血清素代谢通路的关键调控因子。研究发现不仅扩展了MADS-box蛋白在果实结构发育之外的功能范围，还包括神经活性代谢物的微调。该调控模块的进化保守性表明其在代谢工程培育营养增强型作物和研究血清素在植物中的生理作用方面具有潜在应用价值。通过精确调控血清素生物合成通路的关键节点，为未来作物品质改良和功能性食品开发提供了新的分子靶点和理论依据。
