胸腺肽选择性决定CD8+T细胞功能亚群分化的新机制：β5t肽与非β5t肽通过调控TCR信号持续性引导谱系命运

本研究针对胸腺中MHC-I限制性CD8+T细胞如何获得不同功能（辅助、细胞毒、先天记忆）这一核心问题展开。研究人员构建了CD8Dual基因工程小鼠（其Cd4和Cd8基因座均编码CD8共受体），发现功能迥异的CD8+T细胞亚群由不同的MHC-I胸腺选择肽筛选产生。具体而言，由胸腺皮质上皮细胞（cTEC）特异性胸腺蛋白酶体（thymoproteasome）产生的β5t肽仅能选择产生常规细胞毒性CD8+T细胞（CV），而广泛表达于胸腺的非β5t肽则能选择产生辅助性（helper）和先天记忆样（IM）CD8+T细胞。其根本机制在于不同肽在胸腺内的分布差异导致了T细胞抗原受体（TCR）信号持续性的不同：β5t肽信号因胸腺细胞离开皮质而中断，诱导细胞毒命运；非β5t肽信号可在外周持续或重现，诱导辅助或IM命运。该研究发表于《Nature Immunology》，首次将肽特异性、T细胞功能与胸腺迁移过程整合，揭示了胸腺选择中CD8+T细胞功能异质性的产生新机制，对理解适应性免疫细胞发育具有里程碑意义。

在我们身体的免疫司令部——胸腺中，未成熟的T细胞前体经历一场严格的“选拔”才能成为合格的免疫战士。其中，CD8⁺T细胞通常被认为是专职的“杀手”细胞，负责清除被病毒感染或癌变的细胞。然而，免疫系统远比我们想象的复杂，CD8⁺T细胞这个群体内部其实也存在分工：有的确实是效应细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cell, CTL），但有的却表现出类似CD4⁺辅助性T细胞（Helper T cell）的功能，甚至还有一类具备“先天记忆”（Innate memory, IM）特性，能够更快速地响应威胁。长期以来，一个核心的谜团困扰着免疫学家：这些功能迥异的CD8⁺T细胞亚群是如何在胸腺这个“训练营”中被塑造出来的？是什么决定了它们不同的命运？

传统的观点认为，T细胞的谱系命运（是成为辅助性还是细胞毒性T细胞）主要取决于其T细胞受体（T cell receptor, TCR）识别的是主要组织相容性复合体II类（MHC-II）还是I类（MHC-I）分子。然而，近年来的“动力学信号模型”提出了更精细的调控机制：命运并非由共受体（CD4或CD8）本身决定，而是由TCR信号在阳性选择过程中的“持续性”决定的。持续的信号会诱导辅助性T细胞的关键转录因子ThPOK，推动细胞向辅助性谱系分化；而中断的信号则会允许细胞因子诱导细胞毒性T细胞的关键转录因子Runx3d表达，推动向细胞毒性谱系分化。但是，是什么控制了TCR信号的这种“持续性”或“中断”呢？特别是对于所有都被MHC-I分子选择的CD8⁺T细胞来说，其内部的功能差异又是如何产生的？这背后是否与它们所识别的具体“身份证”——即由MHC-I分子呈递的特定胸腺肽有关？

为了深入探究MHC-I限制性CD8⁺T细胞的谱系命运决定机制，由Miho Shinzawa和Alfred Singer等人组成的研究团队在《Nature Immunology》上发表了他们的最新研究。他们设计了一个巧妙的遗传学模型——CD8^Dual小鼠。这种小鼠的Cd4和Cd8基因座都编码CD8共受体蛋白，但分别产生略有差异的CD8.1（由Cd4基因座编码）和CD8.2（由Cd8基因座编码）共受体。这一设计使得研究人员能够剥离共受体蛋白本身的功能，而专注于研究编码这些共受体的基因座（Cd4 或 Cd8）对TCR信号动力学和细胞命运的固有影响。

研究人员主要运用了基因工程小鼠模型构建、流式细胞术（Flow Cytometry）进行免疫表型分析、体外T细胞功能刺激实验、RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析、实时定量PCR（RT-qPCR）、以及通过 Rag-GFP 报告基因追踪胸腺细胞发育时序等关键技术方法。

CD8^Dual小鼠揭示Cd4与Cd8基因座导向不同的CD8⁺T细胞功能谱系

在CD8^Dual小鼠胸腺和外周淋巴器官中，表达CD8.1共受体的T细胞和表达CD8.2共受体的T细胞均是由MHC-I分子选择产生的。然而，它们却走上了截然不同的道路。CD8.1 T细胞高表达辅助性T细胞的关键转录因子ThPOK，其转录谱和分子表达模式与野生型小鼠的CD4⁺辅助性T细胞相似。功能上，在体外刺激后，它们能上调辅助性分子CD40L，并能在TH2极化条件下产生IL-4。更重要的是，在CD8^Dual小鼠胸腺内，也存在由CD8.1 T细胞分化而来的调节性T细胞（T_reg）和恒定自然杀伤T细胞（iNKT）各亚群（NKT1, NKT2, NKT17）。相反，CD8.2 T细胞则高表达细胞毒性T细胞的关键转录因子Runx3d，其特性与野生型小鼠的CD8⁺细胞毒性T细胞类似，在刺激后能产生IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B），并且在淋巴耗竭环境下具有更强的增殖能力。这些结果清晰地表明，即使表达的均是CD8共受体，由Cd4基因座编码的共受体倾向于推动T细胞向辅助性谱系分化，而由Cd8基因座编码的共受体则倾向于推动向细胞毒性谱系分化。

共受体动力学与阳性选择中的TCR信号持续时间

那么，Cd4和Cd8基因座是如何造成这种差异的呢？答案在于它们对共受体表达动力学的调控不同，进而影响了TCR信号的持续时间。研究人员通过分析胸腺细胞阳性选择不同阶段（通过CD69和CCR7表达划分）的共受体表达和信号强度指标（如CD5），发现CD8.2（Cd8基因座编码）的表达在TCR信号后急性下降，而CD8.1（Cd4基因座编码）的表达则稳步上升。这与“动力学信号模型”中Cd8基因表达会瞬时终止的概念一致。重要的是，依赖于Cd4编码的CD8.1共受体的MHC-I TCR信号是持续性的，这诱导了ThPOK的表达；而依赖于Cd8编码的CD8.2共受体的TCR信号则发生了中断，从而允许Runx3d的表达。成熟T细胞上CD5和Nur77（TCR信号强度指标）的表达水平差异也印证了这一点，CD8.1 T细胞始终表现出更强的信号痕迹。

不同MHC-I胸腺选择肽选择功能不同的CD8⁺T细胞

接下来，研究团队探索了更根本的问题：是什么初始因素决定了TCR信号的持续性或中断？他们将目光投向了TCR识别的对象——胸腺肽。胸腺肽主要由胸腺皮质上皮细胞（cTEC）加工产生。其中，cTEC特有的胸腺蛋白酶体（含有β5t亚基）产生β5t肽，而其他蛋白酶体则产生非β5t肽。关键区别在于，β5t肽仅存在于cTEC，而非β5t肽在胸腺内广泛表达（包括cTEC和皮质髓质交界处/髓质细胞）。

通过比较β5t基因野生型（β5t^WT）和敲除型（β5t^KO）的CD8^Dual小鼠，研究人员有了惊人发现：CD8.1辅助性T细胞的产生完全不受β5t缺失的影响，说明它们完全由非β5t肽选择。而CD8.2细胞毒性T细胞的产生则部分依赖于β5t肽（在β5t^KO小鼠中减少约50%），表明它们可由β5t肽和非β5t肽共同选择。进一步分析发现，由β5t肽选择的CD8.2 T细胞是常规的细胞毒性T细胞（CV, Runx3⁺Eomes^-），而在β5t^KO小鼠中残存的、由非β5t肽选择的CD8.2 T细胞则几乎全是先天记忆样T细胞（IM, Runx3⁺Eomes⁺）。IM细胞的生成依赖于IL-4，并在PLZF^KO或CD1d^KO（缺乏iNKT细胞）小鼠中被废除。通过Rag-GFP报告基因分析发育时序，发现IM CD8⁺T细胞的出现比CV细胞晚约10小时，且CD5表达更高，提示其接受了由非β5t肽在胸腺皮质外区域（如髓质）引发的“晚期TCR信号”。这种晚期信号可能延迟了胸腺细胞的迁出，使其有更多时间暴露于由NKT2细胞产生的IL-4中，从而促进IM表型的获得。

机制在野生型小鼠中的普适性

为了验证这一机制并非CD8^Dual小鼠特有，研究团队在野生型BALB/c和C57BL/6（B6）小鼠中进行了验证。在富含IL-4和NKT2细胞的BALB/c小鼠中，β5t的缺失同样几乎完全废除了CV CD8⁺T细胞的生成，但不影响IM CD8⁺T细胞。而在缺乏IL-4、IM CD8⁺T细胞本就极少的B6小鼠中，β5t缺失也主要影响CV细胞的生成。这表明，不同胸腺肽选择不同功能CD8⁺T细胞的机制是普遍存在的，而不同品系小鼠胸腺内细胞因子环境（如IL-4水平）的差异决定了IM细胞群体的规模。

研究结论与意义

本研究得出了颠覆性的结论：CD8⁺T细胞的功能命运并非预先注定，而是在胸腺阳性选择过程中，由特定MHC-I胸腺选择肽通过调控TCR信号持续时间来精确决定的。β5t肽由于其局限于胸腺皮特的分布，其介导的TCR信号在胸腺细胞离开皮质时必然中断，从而专一性地产生细胞毒性CD8⁺T细胞。而非β5t肽因其在胸腺内广泛分布，使得TCR信号有可能持续（诱导辅助性命运）或在皮质外重现（“晚期信号”，与IL-4协同诱导先天记忆命运）。因此，是肽在胸腺内的“空间分布”特性，而非其绝对的序列特征，最终决定了其所选择的CD8⁺T细胞的功能属性。

这项研究成功地整合了T细胞识别的肽特异性、T细胞的功能获得以及胸腺细胞的迁移过程这三个关键维度，为理解胸腺中CD8⁺T细胞功能异质性的起源提供了全新的框架。它不仅深化了对T细胞发育生物学的认识，也对未来旨在定向调控T细胞功能（例如，在肿瘤免疫治疗或自身免疫病干预中）的策略提供了重要的理论基础。