冷冻电镜揭示可溶性甲烷单加氧酶羟基化酶中MMOB不对称变构激活的分子机制

本文通过冷冻电镜（cryo-EM）首次解析了可溶性甲烷单加氧酶（sMMO）羟基化酶（MMOH）与单一调控蛋白MMOB形成的非对称复合物（H-1B）高分辨率结构（2.85 Å）。研究发现，MMOB结合诱导MMOH二聚体产生不对称变构效应，使结合亚基（HBA）的二铁活性中心Fe···Fe距离缩短至2.7 Å，更利于O2活化；同时Thr213构象变化打开底物通道。该工作揭示了MMOB通过β亚基N端引发变构级联、γ亚基调控不对称性的新机制，为理解sMMO连续催化甲烷羟基化提供了结构基础。

1 引言

甲烷（CH₄）是一种强效温室气体，其C─H键解离能高（约104.9 kcal/mol），难以在常温下活化。可溶性甲烷单加氧酶（sMMO）可在常温常压下将甲烷转化为甲醇，其活性依赖于羟基化酶（MMOH）、调控蛋白（MMOB）和还原酶（MMOR）的协同作用。以往晶体结构显示MMOB对称结合于MMOH二聚体的“峡谷区域”，但晶体堆积可能掩盖了溶液状态下的动态不对称性。冷冻电镜技术能够捕捉近天然状态下的构象异质性，为揭示sMMO的变构调节机制提供了新机遇。

2 结果与讨论

2.1 近天然状态下MMOH–MMOB复合物的动态特征

通过冷冻电镜单颗粒分析及三维变异性分析（3DVA），发现溶液中MMOH–MMOB主要以不对称的H-1B形式存在（占比58%），即单个MMOB结合于MMOH的一个原体（protomer），形成MMOB结合原体（HB^A，αβγB）与非结合原体（HB^B，αβγ）。该构象在晶体结构中未被观察到，提示其可能是催化相关功能状态。高分辨率结构（2.85 Å）显示，HB^A处于活化状态，而HB^B保持静息状态，支持原体交替催化的模型。

2.2 MMOB驱动的从表面到二铁活性中心的变构效应

MMOB结合引发从HB^Aβ亚基N端（NT-HB^Aβ）开始的变构级联：Gln5与MMOB的Asp71形成氢键，进而通过螺旋E、F、G、H和4传递构象变化，导致二铁中心配位几何改变。MMOB的C端区域（CT-MMOB）通过疏水作用与螺旋H、F互作，进一步稳定活化构象。γ亚基通过其C端α8螺旋与MMOHα相互作用，不对称地稳定HB^A并松弛HB^B，表明其不仅是结构支架，更参与变构调控。

2.3 具有2.7 Å Fe—Fe距离的活性原体

HB^A中原铁距离缩短至2.7 Å，更接近O₂活化中间体（Q中间体）的推测几何；而HB^B保持3.1 Å，对应于氧化态（MMOH_ox）。Glu243在HB^A中以双齿配位方式连接Fe1和Fe2，类似于还原态（MMOH_red），提示MMOB结合可能促进电子传递与铁中心还原。MMOB的Phe75、Ser109、Ser110等残基通过影响第二、三配位层残基（如Thr213、Glu114）间接调控二铁中心压缩。

2.4 MMOB重构疏水空腔以促进CH₄和O₂进入

在静息态MMOH和HB^B中，疏水空腔1和2因Thr213侧链取向而断开；HB^A中Thr213旋转使疏水空腔连续化，形成直径约5.5 Å的底物通道。该通道由Phe188和Leu110等残基构成，便于小分子（如O₂、CH₄）扩散至活性中心。空腔开闭由MMOB通过变构调控Thr213实现，体现了原体功能不对称性。

3 结论

本研究通过冷冻电镜结构揭示了sMMO催化循环的不对称机制：MMOB结合诱导HB^A原体二铁中心压缩（2.7 Å）和底物通道开放，而HB^B原体保持静息状态以备电子传递。结合荧光淬灭实验显示MMOB不干扰MMOR与MMOH结合，支持MMOB与MMOR可交替结合原体、实现连续催化的模型。该工作为理解甲烷羟基化动态机制及设计仿生催化剂提供了结构基础。

4 实验方法

MMOH、MMOB、MMOR源自Methylosinus sporium5，经发酵与柱层析纯化。MMOH–MMOB复合物在冷冻电镜网格上制备，数据采集于300 kV Krios G4显微镜，经cryoSPARC处理及3DVA分析。模型通过Phenix和Coot进行实空间优化，结合能通过色氨酸荧光淬灭测定。