WIN332免疫原的设计与表征
WIN332是一种基于HIV-1 clade A/E毒株BG505改造的工程化天然样Env SOSIP三聚体。该免疫原的创新之处在于主动删除了Asn332位点的特征性潜在N-连接糖基化位点（PNGS），同时保留此前在RC1免疫原中已去除的Asn133、Asn137和Asn156位点聚糖。质谱分析证实WIN332在Asn133、Asn137、Asn156和Asn332位点确实缺乏糖基化，而在Asn301位点保留糖基化。通过尺寸排阻色谱和负染电镜验证，WIN332形成良好的三聚体结构，并保留对靶向CD4结合位点（CD4bs）、V1V2、V3聚糖及gp120-gp41界面等多种广谱中和抗体的高结合力，而对非中和抗体结合微弱或检测不到。
WIN332与V3聚糖抗体前体的结合特性
通过生物层干涉技术（BLI）分析WIN332与人类I型和II型V3聚糖bNAb前体（包括推断种系株iGL和未突变共同祖先UCA）的结合能力。结果显示，尽管缺乏Asn332聚糖，WIN332仍能与PGT121、BG18、DH270、PCDN76和BF520等I型bNAb前体以不同亲和力结合（KD范围10−2至10−6M）。尤为重要的是，WIN332还能以10−4M的亲和力结合II型bNAb EPTC112的前体。值得注意的是，BF520的UCA对WIN332的亲和力（1.5×10−6M）甚至高于对含Asn332聚糖的RC1的亲和力（1.48×10−5M），表明Asn332聚糖的缺失反而有利于某些前体抗体的结合。在表达iGL PGT121的免疫球蛋白敲入小鼠中，WIN332能够成功启动抗体应答，证实其与低亲和力前体的结合在生物学上具有意义。
WIN332在非人灵长类中激发Asn332聚糖非依赖的V3聚糖抗体
研究人员对恒河猴进行单次皮下免疫，注射WIN332佐剂制剂，并在免疫后3周和7周采集血液和引流淋巴结样本。ELISA分析显示，免疫后动物血清对WIN332产生强劲的抗体应答（平均终点滴度956）。血清抗体结合依赖于完整的GDIR motif，因为将其突变为GAIA会显著降低结合。血清能够结合逐步糖基化程度更高的Env变体（WIN332 > RC1 > 11MutB > 10Mut > 7Mut > 5Mut > BG505），并对完全糖基化的BG505 SOSIP三聚体有低但可检测的结合。竞争ELISA表明，血清中部分抗体靶向V3聚糖表位，因为PGT121（V3聚糖bNAb）可竞争性抑制约41.2%的血清结合。
电镜多克隆表位定位（EMPEM）分析进一步证实了血清中存在靶向V3聚糖表位的抗体。使用WIN332和RC1三聚体与血清Fab片段形成的复合物进行电镜分析，揭示了抗体与V3聚糖表位的结合，并且这些抗体能够容纳RC1上的Asn332聚糖。将复合物的电子密度与已发表的BG18、PGT121和EPTC112等bNAb的结构进行比较，显示出高度的结构相似性。
WIN332激发的中和血清反应
从免疫后第7周的血清中纯化免疫球蛋白，并通过TZM-bl实验评估其中和活性。血清对WIN332和RC1假病毒表现出强中和活性，对11MutB、10Mut、7Mut和5Mut假病毒的中和活性逐步降低。值得注意的是，血清对完全糖基化的自体BG505假病毒（BG505 Thr332Asn）显示出低但可重复的抑制活性，表明具有中和潜力。这种活性是V3聚糖表位特异性的，因为针对敲除V3聚糖表位的BG505 Asn301Ala假病毒或鼠白血病病毒（MLV）对照均未检测到中和活性。
WIN332激发的单克隆抗体特征
从免疫后3周的淋巴结中分离WIN332特异性或BG505特异性的生发中心B细胞，并克隆其免疫球蛋白基因。测序分析显示广泛的B细胞克隆扩增，VH、VK和VL基因的平均体细胞超突变（SHM）核苷酸数分别为5.7、2.8和6.1，平均CDRH3长度为14.4个氨基酸。约73%的lambda轻链（IgL）含有已知人类I型和II型V3聚糖bNAb的CDRL3 motif，如I型bNAb的"QxDSS" motif和II型bNAb EPTC112的"SYxG" motif。约43%的kappa轻链（IgK）含有DH1030、BF520和PCDN.76等bNAb的CDRL3 motif。CDRH3分析也发现了与EPTC112、DH270、PGT121、BG18等多种bNAb相关的关键motif。
研究人员从中挑选了43个具有人类V3聚糖bNAb特征motif的mAbs进行生产。ELISA结合实验表明，所有43个mAbs均能结合WIN332，其中40个能结合RC1，32个能结合11MutB，13个能结合完全糖基化的BG505三聚体。竞争ELISA证实，30个mAbs的结合可被PGT121竞争抑制（平均抑制率74.8%）。这些mAbs对WIN332的平均亲和力（KD）约为10−9M。
Ab1999：一种中和性BG18样抗体
Ab1999因其与人类I型V3聚糖bNAb BG18的高度相似性而被选中进行深入分析。其重链（HC）与iGL BG18的HC有76.7%的氨基酸同源性，并含有BG18样抗体中关键的"FGVV" CDRH3 motif。Ab1999使用猕猴VH4-106基因，CDRH3长度为22个氨基酸，仅比BG18短一个氨基酸。其VH和VK基因分别有2个和14个核苷酸的SHM。
Ab1999能结合WIN332、RC1、11MUTB、10MUT和7MUT，但不结合敲除V3聚糖表位的WIN332glycanKO（缺失Asn301聚糖），且对WIN332-GAIA的结合减弱，证实其V3聚糖表位特异性。在TZM-bl实验中，Ab1999对WIN332、RC1和11MutB假病毒显示出高中和活性，对更接近天然状态的假病毒中和活性逐步降低，并对完全糖基化的BG505假病毒显示出低但可重复的中和活性，而对BG505 Asn301Ala或MLV无中和作用。
通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了Ab1999 Fab与RC1复合物的结构（分辨率3.9 Å）。结构显示，单个Ab1999 Fab通过其长CDRH3环与RC1结合，主要接触V1、V2和V3区域，未观察到抗体与聚糖的相互作用。Ab1999通过氢键和疏水作用与V1环相互作用，与V2环有较弱的范德华力接触，并通过CDRH3顶端的TxFGVV motif与V3环的Met328等残基形成疏水核心。与成熟BG18相比，Ab1999（以及BG18 iGL）的结合更依赖于V1环而非V3环，提示其处于早期成熟阶段。
Ab1983：一种EPTC112样抗体
Ab1983因其与人类II型V3聚糖bNAb EPTC112的惊人相似性而被选中。其HC与iGL EPTC112的HC有83.3%的氨基酸同源性，并含有EPTC112中和活性所必需的所有关键motif，包括CDRH1中的两个丝氨酸和一个酪氨酸、CDRH2中的一个丝氨酸以及CDRH3中的"SGW" motif。Ab1983使用猕猴VH4S13和DH6-31基因，与人类EPTC112使用的VH4-59和DH6-19基因分别有91.7%和95.2%的同源性。其VH和VL基因分别仅有3个和1个核苷酸的SHM，CDRH3长度为14个氨基酸，与EPTC112的15个氨基酸相近。
Ab1983能高亲和力结合WIN332和RC1，但不结合11MutB、天然BG505或WIN332 glycan KO，表明其结合依赖于Asn301聚糖。对WIN332-GAIA的结合减弱也支持其依赖完整的GDIR motif。
通过冷冻电镜解析了Ab1983 Fab与WIN332复合物的结构（分辨率3.8 Å）。结构显示两个Ab1983 Fab结合到WIN332三聚体上。Ab1983主要通过其重链与V3环相互作用，涉及氢键和疏水接触。其CDRH2（Ile53, Ser54, Glu55）与Asn301聚糖发生关键接触。Ab1983还通过CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3与V1环广泛相互作用，与V2环的接触有限。与EPTC112类似，Ab1983以Asn332聚糖非依赖的方式识别V3聚糖表位，主要通过与V1、V3和Asn301聚糖的相互作用。
序贯免疫增强WIN332激发的免疫反应
为了增强WIN332激发的免疫反应，研究人员在初次免疫后第8周使用7Mut-ST2-Asn332Tyr免疫原对猕猴进行加强免疫。该免疫原是在7Mut基础上，通过引入PNGS位点掩蔽糖基化空穴和三聚体基部，并在332位点引入酪氨酸以模拟Asn332聚糖的庞大侧链。
加强免疫诱导了WIN332特异性抗体的亲和力成熟。与初次免疫相比，加强免疫后分离的B细胞其VH和VL基因的平均SHM核苷酸数分别增加至12.7和6.9。血清对加强免疫原7Mut-ST2-Asn332Tyr的结合显著增强，并且对完全糖基化的BG505三聚体以及异源三聚体Q23.17、AD8和001428的结合也显著增强。
更重要的是，加强免疫显著提高了血清对完全糖基化BG505假病毒的中和活性。通过使用BG505系列突变假病毒（BG505 Asn137Asp, BG505 Asn156Ala, BG505 Asn301Ala）进行中和表位作图，证实中和活性部分特异于V3聚糖表位。虽然针对24种不同亚型的HIV-1假病毒面板未观察到50%以上的中和活性，但对其中7种病毒观察到了高于MLV背景的低水平抑制，这些病毒天然缺乏Asn133、Asn137和/或Asn332位点的聚糖，这与WIN332免疫原的设计特点一致。
讨论与展望
序贯免疫是激发抗HIV-1 bNAb的有前景策略。本研究通过谱系"不可知论"的免疫原设计方法，旨在激活针对保守V3聚糖表位的多种抗体谱系，增加了激活具有成熟为bNAb潜力的抗体谱系的概率。
研究结果支持了以下假设：存在不依赖Asn332聚糖的V3聚糖抗体谱系（II型），并且Asn332聚糖依赖性可能在bNAb成熟过程中发展而来。WIN332能够快速激发具有中和活性的Asn332聚糖非依赖抗体，且这些抗体与人类I型和II型V3聚糖bNAb高度相似。单次免疫即可诱导针对完全糖基化自体病毒的低水平中和活性，并通过序贯加强免疫得到增强。
值得注意的是，本研究中分离的中和抗体Ab1999和Ab1983均具有较低的SHM水平，提示中等程度的SHM可能足以产生中和活性。特别是II型抗体Ab1983，其CDRH3长度（14个氨基酸）接近人类抗体库的平均水平，预示着这类抗体可能更容易通过免疫被激发。
WIN332作为一种新型免疫原，能够激活"优质"的Asn332聚糖非依赖抗体谱系，加速中和抗体的发展，为简化针对HIV-1的序贯免疫方案提供了极具潜力的候选疫苗策略。
