引言
克罗恩病（Crohn's disease, CD）是一种累及全胃肠道的慢性透壁性炎症疾病，其特征是进行性肠壁纤维化导致狭窄和管腔梗阻，尤其好发于回肠末端。纤维化是当前CD治疗的主要挑战，而深入理解纤维狭窄病变（fibrostenosing lesions, FSLs）的局部细胞组成与相互作用机制，可能为开发靶向疗法提供新思路。本研究通过结合手术切除样本的组织病理学分析、单细胞RNA测序（scRNA-seq）及定量图像分析，系统揭示了CD FSL中各肠壁层次（黏膜、黏膜肌层、黏膜下层、固有肌层、浆膜）的结构改变、胶原沉积规律以及免疫细胞-内皮细胞-间质细胞的相互作用网络。
材料与方法
研究纳入30例正常回肠对照组（NC）和30例CD FSL手术样本，通过苏木精-伊红（H&E）、天狼星红（PSR）染色及免疫组化（针对SMA、CD3、CD4、CD8、CD20、CD31、CD68等标志物）进行组织学分析。利用QuPath软件对肠壁各层进行人工注释和像素分类，量化胶原面积、免疫细胞密度及淋巴聚集（CLAs）分布。新鲜样本通过scRNA-seq技术（基于GRCh38人参考基因组）解析细胞类型组成，并通过CellChat工具推断配体-受体互作网络。统计学分析采用Wilcoxon检验、Kruskal-Wallis检验等进行组间比较。
结果
肠壁层次结构与胶原沉积的定量变化
CD FSL样本中黏膜层因溃疡而面积显著减少，但黏膜肌层因平滑肌增生/肥厚和胶原沉积扩张达4.5倍，浆膜层也因脂肪包裹（creeping fat）而扩大。天狼星红染色显示，除黏膜外，其余各层胶原密度均显著增加，其中黏膜下层胶原沉积最显著（图1-2）。黏膜下层脂肪组织减少并被纤维化和免疫细胞浸润取代，而浆膜层胶原与脂肪组织同步增生，符合“脂肪包裹”现象。
淋巴细胞、CLAs及巨噬细胞的跨壁浸润
正常回肠的黏膜相关淋巴组织（MALT）局限于黏膜层，而CD FSL中CLAs呈跨壁分布（黏膜下层>浆膜层>肌层），且B细胞（CD20+ ）与T细胞（CD3+ /CD4+ /CD8+ ）在CLAs内混合浸润，与正常MALT中生发中心-套区结构截然不同（图3）。巨噬细胞（CD68+ ）在CD FSL各层均增加，尤其黏膜肌层增加7倍，但仅13%病例出现肉芽肿，提示肉芽肿并非纤维狭窄的必要条件。
内皮细胞簇围绕CLAs聚集
CD31+ 内皮细胞在CD FSL的黏膜下层、固有肌层和浆膜层显著增生（黏膜肌层增加7.2倍），并以簇状形式密集环绕CLAs分布，密度可达10,000个/mm2 （图4）。相关性分析显示，内皮细胞数量与CLAs数量（r=0.84）及胶原沉积程度在黏膜下层和浆膜层高度正相关，提示内皮-CLA单元与纤维化空间共定位。
scRNA-seq揭示细胞互作信号网络
scRNA-seq证实CD FSL中内皮细胞、淋巴细胞、髓系细胞比例增加，而上皮细胞因溃疡减少。CellChat分析发现，GAS（内皮/基质细胞→巨噬细胞）、SELL（CD8 T细胞→内皮细胞）、SELPLG（巨噬细胞/树突状细胞→T细胞/内皮细胞）等通路在CD FSL中活跃（图5-6）。内皮细胞表现出最强的信号流出/流入活性，其与淋巴细胞、巨噬细胞通过ANGPT、PECAM1/2、COLLAGEN等多通路交互，可能协同激活成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，促进胶原沉积。
讨论
本研究首次通过层特异性定量分析，明确CD FSL纤维化的核心区域为黏膜下层，并提出“CLAs-内皮簇-胶原三角轴”概念。内皮细胞簇通过GAS、SELL等信号途径与淋巴细胞、巨噬细胞形成炎症-纤维化微环境，驱动黏膜下层纤维化向周围层次扩展。缺乏肉芽肿的多数病例仍见广泛巨噬细胞浸润，提示M2型巨噬细胞的促纤维化作用。研究局限性在于成纤维细胞/肌成纤维细胞特异性标记物缺失，需空间转录组学进一步解析亚群异质性。
结论
CD纤维狭窄并非静态瘢痕，而是由CLAs-内皮细胞网络动态调控的活性过程。黏膜下层作为纤维化“ nucleation 中心”，其GAS、SELPLG等通路可能成为抗纤维化治疗新靶点。
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